التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em> في المختبر</em> الالتزام الفحص
Summary
في فحوصات المختبر التقيد يمكن استخدامها لدراسة إلحاق العقدية الرئوية لالظهارية الطبقات الوحيدة الخلية والتحقيق التدخلات المحتملة مثل استخدام البروبيوتيك لتثبيط استعمار المكورات الرئوية.
Abstract
تمسك العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) لبطانة الظهارية من البلعوم الأنفي يمكن أن يؤدي إلى الاستعمار، ويعتبر شرطا أساسيا للعدوى المكورات الرئوية مثل الالتهاب الرئوي والتهاب الأذن الوسطى. في المختبر فحوصات الالتزام يمكن استخدامها لدراسة المرفق من المكورات الرئوية إلى الخلايا الظهارية الطبقات الوحيدة للتحقيق والتدخلات المحتملة، مثل استخدام البروبيوتيك، لمنع استعمار المكورات الرئوية. يتم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا للتحقيق في الآثار المترتبة على اللعابية العقدية بروبيوتيك على التزام المكورات الرئوية إلى خط الخلايا الظهارية البشرية CCL-23 (التي يشار إليها أحيانا التهاب الكبد-2 خلايا). ينطوي على فحص ثلاث خطوات رئيسية: 1) إعداد الخلايا الظهارية والبكتيرية، 2) إضافة إلى البكتيريا الظهارية الطبقات الوحيدة الخلية، و3) الكشف عن المكورات الرئوية تمسكا من قبل التهم قابلة للحياة (التخفيف المتسلسل وتصفيح) أو الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR ). هذا تكhnique واضح ومباشر نسبيا ولا تتطلب معدات متخصصة أخرى من الإعداد زراعة الأنسجة. الفحص يمكن استخدامها لاختبار أنواع الكائنات الحية المجهرية الأخرى و / أو مثبطات المحتملة للاستعمار المكورات الرئوية ويمكن تعديلها بسهولة لمعالجة المسائل العلمية الأخرى بشأن الانضمام المكورات الرئوية والغزو.
Introduction
العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) هي نوع من البكتيريا موجبة الجرام التي يمكن أن تسبب العدوى بما في ذلك الالتهاب الرئوي والتهاب الأذن الوسطى، والتهاب السحايا. بل هو سبب رئيسي للمرض في الأطفال في البلدان المنخفضة الدخل ومسؤولة عن ما يقدر ب 800،000 حالة وفاة للأطفال دون سن الخامسة سنويا 1. وكثيرا ما تتم المكورات الرئوية في البلعوم الأنفي للأطفال الصغار. على الرغم من أن هذا الاستعمار يعتبر عموما أعراض، فإنه يسبق عدوى المكورات الرئوية وبمثابة خزان للبكتيريا في التجمعات البشرية 2. تطعيم المكورات الرئوية بشكل فعال يقلل من نقل الأنماط المصلية الواردة في اللقاح. ومع ذلك، هناك أكثر من 90 الأنماط المصلية للمكورات الرئوية، والتطعيم يمكن أن يؤدي إلى استبدال النمط المصلي، حيث يتبع القضاء على الأنماط المصلية لقاح ارتفاع في النقل والأمراض الناجمة عن الأنماط المصلية nonvaccine 3. أيضا، في بعض المجموعات السكانية المعرضة للخطر، المكورات الرئويةالاستعمار غالبا ما يحدث في الحياة في وقت مبكر جدا، قبل إعطاء الجرعة الأولى لقاح 4،5. في الآونة الأخيرة، وقد اقترح استخدام البروبيوتيك باعتباره استراتيجية إضافية لمنع الالتهاب الرئوي الاستعمار 6،7. وقد استخدمت في المختبر فحوصات التمسك دراسة التقيد المكورات الرئوية 8،9. وقد تم تكييف هذه المقايسات للتحقيق في تأثير بروبيوتيك rhamnosus اكتوباكيللوس GG (LGG) على الالتزام المكورات الرئوية 10.
بالإضافة إلى LGG وغيرها من بكتيريا حمض اللاكتيك، المكورات العقدية اللعابية، وهو من سكان شيوعا من تجويف الفم، وقد تم التحقيق باعتباره بروبيوتيك المحتملة لالجهاز التنفسي بسبب الاستعمار إمكاناتها وقدرتها على تثبيط المكورات الرئوية ومسببات الأمراض التنفسية الأخرى في المختبر 11 – 13. بروتوكول المعروضة هنا يصف مقايسة التقيد تستخدم للتحقيق في آثار S. اللعابية K12 على الالتزام المكورات الرئويةإلى خط الخلايا الظهارية البشرية CCL-23. قبل استخدامها في الفحص، وجرى تقييم عزلات المكورات الرئوية لقدرات الالتزام، والنمو وخصائص الالتزام يمكن أن تختلف بشكل كبير بين العزلات 10،14. منحنيات نمو المكورات الرئوية وS. أجريت اللعابية لتحديد مرحلة منتصف السجل والتركيز تقدير (وحدات تشكيل مستعمرة أو كفو / مل) من خلال الكثافة الضوئية (OD، الشكل 1). فمن المستحسن لدراسة النمو من خلال عدد قابلة للحياة والتطوير التنظيمي لكل عزل قبل استخدامها في الفحص. هذا الاختبار لا يمكن أن يؤديها في أي مختبر زراعة الأنسجة مع مرافق القياسية والمعدات. في هذا البروتوكول، وآثار ثلاث جرعات من S. اللعابية تدار 1 ساعة قبل إضافة المكورات الرئوية على التزام S. PMP843 الرئوية، وهو النمط المصلي 19F عزل النقل المستمدة من مسحة البلعوم، ويتم فحص. يتم عرض طريقتين مختلفتين لتقدير المكورات الرئوية تمسكا: الطلاء على أجار الدم لردعالألغام التهم قابلة للحياة، واستخراج الحمض النووي والكشف عن الجين lytA المكورات الرئوية التي كتبها QPCR 15. تمسك بروتوكول الفحص الأساسية يمكن تعديلها بسهولة لاختبار الجرعات أو الوقت لإقامة البروبيوتيك مختلفة، ويمكن أن تستخدم أيضا مع السلالات أو الأنواع البكتيرية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
جزء حاسم من هذا الاختبار هو إضافة تركيزات مناسبة من S. اللعابية والمكورات الرئوية في الأقسام 3.1.7 و3.1.12. وتقدر تركيزات باستخدام قراءات OD ولكن لم يتم تحديد قائح بالضبط حتى تحسب لوحات في اليوم التالي. لهذا السبب، فإننا ننصح أداء منحنيات النمو لقياس OD وتعول قابلة للحي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من معهد أبحاث الطفولة مردوخ وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة فيكتوريا.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
References
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
- Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
- Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
- Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
- Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
- Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
- Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
- Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
- Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
- Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
- Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
- Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
- Carvalho, M. d. G. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
- Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
- Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
- Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).
