Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация
Summary
Покадровый микроскопия позволяет визуализировать процессы развития. Рост или дрейф образцов во время получения изображения снижает способность точно следовать и измерения движения клетки в процессе разработки. Мы описываем использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерной образца дрейфа во времени.
Abstract
Поколение четырехмерных (4D) конфокальной данных; , состоящий из последовательностей изображений 3D в течение долгого времени; обеспечивает отличную методику, чтобы захватить клеточные поведения, связанные с процессами развития. Возможность отслеживать и следовать клеточные движения ограничена образцов движений, которые происходят из-за дрейфа образца или, в некоторых случаях, рост в течение получения изображений. Отслеживание клетки в наборах данных, пострадавших от дрейфа и / или роста будет включать эти движения в любом анализе положения клеток. Это может привести к видимым движением статических структур в образце. Поэтому до отслеживания клеток, любой образец дрейф должно быть исправлено. Использование с открытым исходным кодом Фиджи распределение 1 из ImageJ 2,3 и включены локусов инструменты 4, мы разработали правильный 3D дрейфа плагин для удаления ошибочной движение образца в конфокальной данных. Этот протокол эффективно компенсирует перевода образца или изменением фокусного роsition, используя корреляцию фаз для регистрации каждого тайм-точку четырехмерного конфокальной наборов данных, сохраняя при этом способность визуализировать и измерять движения клетки в течение длительного экспериментов покадровой.
Introduction
Конфокальной визуализации широко используется в клеточной и эволюционной биологии следовать клеточные движения и изменения в морфологии. Захват серию оптических срезов на разных фокальных плоскостях позволяет генерировать трехмерной (3D) модели образца, который затем может быть продлен на четыре измерениях (4D) путем создания покадровой серию 3D данных. Поколение 4D наборов данных позволяет детальное измерение движений и поведения клеток. В долгосрочных покадровой экспериментов он является общим для наблюдения движения образца. Это может быть вызвано небольшими неточностями в контролирующей стадии аппаратной и координационных позиций. В то время как в других случаях, дрейф является результатом движений, вызванных ростом образца или гибкости в образце монтажной СМИ. Существуют методы, чтобы компенсировать или ограничивать эти движения, включая усовершенствование системы фокусировки аппаратных и повышенной жесткости монтажной среды. Однако эти подходы не могут быть применены во многих случаях из-за формирования изображения сдр. до обязаны предоставлять благоприятные условия для поддержания и роста образцов. Программного обеспечения с открытым исходным кодом решения существуют для коррекции движения в 2D с течением времени, через использование StackReg и TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 плагинов в ImageJ или Фиджи, но они не могут применяться к 4D данных.
Для коррекции образца дрейфа мы разработали плагин (Правильное 3D дрейф), чтобы использовать с открытым исходным кодом визуализации обработки платформу, Фиджи 1. Наш плагин способен выполнять фазовой корреляции регистрацию исправить движение, которое происходит в результате выборки дрейфа в трехмерных экспериментов покадровой. Фаза корреляция 6 является вычислительная эффективный метод, чтобы определить различия между изображениями. Плагин описано здесь использует фаза-корреляции библиотеку, разработанную Preibisch др.. 7. В экспериментах многоканальных, плагин использует один канал, чтобы детерпе требуется коррекция. Эта поправка затем применяется к любым дополнительным каналам в результате чего регистрации набора данных 4D.
В данио модели системы можно осуществлять покадровой обработки изображений в течение многих часов или даже нескольких дней 8. Распространенным методом для монтажа данио является внедрение анестезированной живой эмбрион в низкой температурой плавления агарозы (0,8-1,5%), ограничивая свое движение 9-11. В то время как движение ограничено рост образца все еще имеет место, в результате чего клеток в поле зрения меняющихся положение. Для того чтобы проследить движение клеток в эмбрионе, необходимо сначала коррекции движения всей выборки. Этот протокол был разработан с данио образцов, и были использованы в разработке изображение сомитов 12, но может быть применен к любой 4D конфокальной данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наша способность использовать программное обеспечение постобработки исправить образец дрейф наборов данных, полученных из расширенных покадровой экспериментов микроскопии ограничивается рядом факторов. Способность различать дрейф в зависимости от миграционного движения образца …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Gaby Мартинс и организаторов семинара EMBO2010 3D Развивающие изображениями, где началась эта работа и все из авторов проектов Фиджи и ImageJ.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
