Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging
Summary
Time-lapse microscopie kan de visualisatie van ontwikkelingsprocessen. Groei of drift van monsters tijdens beeldacquisitie vermindert het vermogen om nauwkeurig te volgen en te meten cel bewegingen tijdens de ontwikkeling. We beschrijven het gebruik van open source software voor beeldverwerking om te corrigeren voor driedimensionale sample drift in de tijd.
Abstract
Het genereren van vierdimensionale (4D) confocale datasets; bestaande uit 3D-beeld reeksen in de tijd; biedt een uitstekende methode om cellulaire gedrag betrokken zijn bij ontwikkelingsprocessen te vangen. Het vermogen om te volgen en volgt celbewegingen wordt beperkt door monster bewegingen die door drift van het monster of, in sommige gevallen, groei in beeldacquisitie optreden. Tracking cellen in datasets die door drift en / of groei zal deze bewegingen op te nemen in de analyse van de cel positie. Hierdoor kan de schijnbare beweging van statische structuren in het monster. Derhalve vóór cell tracking, moet een monster drift worden gecorrigeerd. Met behulp van de open source Fiji verdeling 1 van ImageJ 2,3 en de opgenomen LOCI hulpmiddelen 4 hebben we de juiste 3D drift plug-in ontwikkeld om foutieve monster verkeer weg in confocale datasets. Dit protocol effectief compenseert proefvertaling of wijzigingen in focale poling door gebruik te maken van fase correlatie met elke keer-punt van een vier-dimensionale confocale datasets registreren met behoud van de mogelijkheid om te visualiseren en meten celbewegingen over langere time-lapse experimenten.
Introduction
Confocale beeldvorming wordt veel gebruikt in de cel-en ontwikkelingsbiologie naar cel bewegingen en veranderingen in morfologie volgen. Vastleggen van een reeks optische secties verschillende beeldvlakken maakt het genereren van een driedimensionaal (3D) model van een monster, dat vervolgens in vier dimensies (4D) kan worden verlengd door een time-lapse reeks 3D datasets. De generatie van 4D datasets maakt gedetailleerde meting van cel bewegingen en gedragingen. In lange-termijn time-lapse experimenten is het gebruikelijk om monster beweging waarnemen. Dit kan worden veroorzaakt door kleine onnauwkeurigheden in de hardware controle podium en focale posities. Terwijl in andere gevallen drift is een gevolg van veranderingen geïnduceerd door groei monster of flexibiliteit in het monster fixeermiddelen. Methoden bestaan om te compenseren of te beperken deze bewegingen, waaronder verbeteringen aan de hardware focussen systemen en verhoogde stijfheid van de montage medium. Echter, deze benadering kan niet worden vaak toegepast vanwege de beeldvormende set up nodig om geschikte omstandigheden voor de monsters onderhoud en groei. Open source software oplossingen bestaan voor de correctie van de beweging in 2D in de tijd, door het gebruik van de StackReg en TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins in ImageJ of Fiji, maar deze kan niet worden toegepast 4D datasets.
Om te corrigeren voor de steekproef drift hebben we een plug-in (Correct 3D drift) om de open-source imaging-processing platform, Fiji 1 voort te brengen. De plug-in kan fase correlatie registratie uit te voeren beweging die optreedt als gevolg van drift monster in driedimensionale time-lapse experimenten corrigeren. Fase correlatie 6 is een computationeel efficiënte methode om de vertaling tussen de beelden te bepalen. De plug-in beschreven gebruikt de fase-correlatie bibliotheek ontwikkeld door Preibisch et al.. 7. In multi-channel experimenten, de plug-in maakt gebruik van het ene kanaal naar determinantenne de benodigde correctie. Deze correctie wordt dan toegepast om extra kanalen waardoor registratie van de 4D dataset.
In de zebravis modelsysteem is mogelijk tot time-lapse imaging gedurende vele uren of zelfs meerdere dagen 8. Een veelgebruikte methode voor het monteren van de zebravis is om de narcose levend embryo te bedden in laag smeltpunt agarose (0,8-1,5%), het beperken van de beweging 9-11. Terwijl beweging beperkt groei van het monster blijft voordoen, waardoor de cellen in het gezichtsveld verschuiven positie. Om beweging van de cellen te volgen binnen het embryo moet eerst corrigeren voor beweging van het gehele monster. Dit protocol werd ontwikkeld met zebravissen specimens, en is gebruikt om het somite ontwikkeling 12 maar kan worden toegepast op elk 4D confocale dataset.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons vermogen om post-processing software gebruiken om monster drift van datasets afkomstig van langere time-lapse microscopie experimenten corrigeren wordt beperkt door een aantal factoren. De mogelijkheid om drift onderscheiden versus migratiestroom van een monster is afhankelijk van de cellulaire merkers gebruikt. Cellulaire merkers die ofwel op grote schaal worden uitgedrukt in een monster of zijn niet betrokken in het vreemdelingenrecht gebeurtenissen tijdens beeldacquisitie bieden de beste bron voor drift correctie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Gaby Martins en de organisatoren van de EMBO2010 3D Developmental Imaging werkplaats waar dit werk begonnen en alle medewerkers aan de Fiji en ImageJ projecten bedanken.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
