Sample Drift Korrektion Efter 4D Confocal Time-lapse Imaging
Summary
Time-lapse mikroskopi tillader visualisering af udviklingsprocesser. Vækst eller afdrift af prøver under billedet erhvervelse reducerer evnen til præcist at følge og måle celle bevægelser under udvikling. Vi beskriver brugen af open source billedbehandling software til at korrigere for tredimensionelle prøve afdrift over tid.
Abstract
Den generation af fire-dimensionelle (4D) konfokal datasæt; bestående af 3D billedsekvenser over tid; giver en fremragende metode til at indfange cellulære adfærd involveret i udviklingsprocesser. Evnen til at spore og følge celle bevægelser er begrænset af prøve bevægelser, der opstår på grund af udflytningen af prøven eller, i nogle tilfælde, vækst i løbet billede erhvervelse. Sporing af celler i datasæt ramt af afdrift og / eller vækst vil indarbejde disse bevægelser i enhver analyse af celle position. Dette kan resultere i den tilsyneladende bevægelse af statiske strukturer inden prøven. Derfor forud for celle tracking, bør enhver prøve afdrift rettes. Brug af open source Fiji fordeling 1 ImageJ 2,3 og monterede loci værktøjer 4, har vi udviklet den rigtige 3D afdrift plug-in for at fjerne fejlagtige prøve bevægelse i konfokal datasæt. Denne protokol effektivt kompenserer for prøve oversættelse eller ændringer i fokal position ved at udnytte fase korrelation til at registrere hver gang-punkt i en fire-dimensional konfokale datasæt samtidig bevare evnen til at visualisere og måle celle bevægelser over længere tid-lapse eksperimenter.
Introduction
Konfokal billeddannelse er almindeligt anvendt i celle-og udviklingsmæssige biologi til at følge celle bevægelser og ændringer i morfologi. Optagelse af en række af optiske sektioner ved forskellige fokale planer muliggør generering af en tredimensional (3D) model af en prøve, som derefter kan udvides i fire dimensioner (4D) ved at skabe en tidsforskudt serie af 3D datasæt. Den generation af 4D datasæt muliggør detaljeret måling af celle bevægelser og adfærd. I langsigtede tidsforskudte eksperimenter er det almindeligt at observere prøve bevægelse. Dette kan være forårsaget af mindre unøjagtigheder i hardware kontrollerende scenen og fokuspositioner. Mens der i andre tilfælde afdrift er et resultat af bevægelser induceret ved vækst prøve eller fleksibilitet i prøven monteringsmedium. Metoder eksisterer for at kompensere eller begrænse disse bevægelser, herunder forbedringer af hardware fokus systemer og øget stivhed i montage medium. Dog kan ikke anvendes disse tilgange i mange tilfælde på grund af billedbehandling set op forpligtet til at give gunstige betingelser for prøver vedligeholdelse og vækst. Findes open source softwareløsninger til korrektion af bevægelse i 2D over tid, gennem brug af StackReg og TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins i ImageJ eller Fiji, men disse kan ikke påføres 4D datasæt.
For at korrigere for prøven afdrift har vi udviklet et plug-in (Korrekt 3D afdrift) for at udnytte open source-imaging-behandling platform, Fiji 1. Vores plug-in er i stand til at udføre fase korrelation registrering til at korrigere bevægelse, der opstår som følge af en prøve afdrift i tredimensionelle tidsforskudte eksperimenter. Fase korrelation 6 er en beregningsmæssige effektiv metode til at bestemme oversættelse mellem billederne. Den plug-in her beskrevne udnytter fase korrelation bibliotek er udviklet af Preibisch et al. 7.. I multi-kanal eksperimenter, plug-in anvender en kanal til beslutsomhedne den nødvendige korrektion. Denne korrektion er derefter anvendt til yderligere kanaler, der resulterer i registreringen af 4D datasættet.
I zebrafisk modelsystem er det muligt at udføre time-lapse billeddannelse over en periode på mange timer eller endda adskillige dage 8. En almindelig metode til montering af zebrafisk er at indlejre bedøvet levende foster i agarose med lavt smeltepunkt (0,8-1,5%), der begrænser dens bevægelse 9-11. Mens bevægelse er begrænset vækst af prøven stadig forekommer, hvilket resulterer i celler i synsfeltet skiftende position. For at følge bevægelsen af celler i embryonet er det nødvendigt først at korrigere bevægelse af hele prøven for. Denne protokol blev udviklet med zebrafisk prøver, og er blevet anvendt til billedet somite udvikling 12, men kan anvendes på enhver 4D konfokal datasæt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores evne til at bruge post-processing software til at korrigere prøve afdrift af datasæt stammer fra udvidede time-lapse mikroskopi eksperimenter er begrænset af en række faktorer. Evnen til at skelne afdrift versus vandrende bevægelse af en prøve er afhængig af de cellulære markører, der anvendes. Cellular markører, der enten almindeligt udtryk i en prøve eller ikke er involveret i vandrende begivenheder i billedet købet give den bedste kilde til afdrift korrektion. Dette plugin bruger en enkelt kanal til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Gaby Martins og arrangørerne af EMBO2010 3D Developmental Imaging workshop, hvor dette arbejde begyndte, og alle bidragyderne til Fiji og ImageJ projekter.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
