Sample Drift Korreksjon Etter 4D Confocal Time-lapse Imaging
Summary
Time-lapse mikroskopi tillater visualisering av utviklingsprosesser. Vekst eller drift av prøvene under bildet oppkjøpet reduserer evnen til å nøyaktig følge og måle celle bevegelser under utvikling. Vi beskriver anvendelse av åpen bildebehandling for å korrigere for tredimensjonale prøve drift over tid.
Abstract
Den generasjonen av fire-dimensjonale (4D) confocal datasett; bestående av 3D-bildesekvenser over tid; gir en utmerket metode for å fange cellulære atferd som er involvert i utviklingsprosesser. Evnen til å spore og følge cellebevegelser begrenses av eksempel bevegelser som oppstår på grunn av drift av prøven eller, i noen tilfeller, vekst under bildeopptak. Sporing celler i datasett rammet av drift og / eller vekst vil innlemme disse bevegelsene inn i noen analyse av celle posisjon. Dette kan føre til at den tilsynelatende bevegelse av statiske strukturer i prøven. Derfor før celle sporing, bør noen prøve drift bli rettet. Bruk av åpen kildekode Fiji distribusjon en av ImageJ 2,3 og innlemmet loci verktøy 4, utviklet vi riktig 3D drift plug-in for å fjerne feilaktige prøve bevegelse i confocal datasett. Denne protokollen effektivt kompenserer for prøveoversettelse eller endringer i fokus posammensetningen ved å utnytte fasekorrelasjons å registrere hver gang-punktet i en fire-dimensjonale datasett confocal samtidig som evnen til å visualisere og måle celle bevegelser over lange tidsintervall eksperimenter.
Introduction
Confocal bildebehandling er mye brukt i celle-og utviklingsbiologi å følge celle bevegelser og endringer i morfologi. Fange en serie av optiske seksjoner ved forskjellige brennplan tillater generering av et tredimensjonalt (3D)-modell av en prøve, som deretter kan forlenges inn i fire dimensjoner (4D) ved å opprette en tidsintervallserie av 3D datasett. Den generasjonen av 4D datasett gir detaljert måling av celle bevegelser og atferd. I langvarige time-lapse eksperimenter er det vanlig å observere prøve bevegelse. Dette kan være forårsaket av små unøyaktigheter i maskinvare styre fasen og kontaktstillinger. Mens i andre tilfeller er drift på grunn av bevegelsene indusert av prøven vekst eller fleksibilitet i prøven festemateriale. Metoder eksisterer for å kompensere eller begrense disse bevegelsene herunder forbedringer i metallfokuseringssystemer og øker stivheten av monteringsmedium. Imidlertid kan disse metodene ikke kan anvendes i mange tilfeller på grunn av den avbildning set opp pålagt å gi gode vilkår for prøvene vedlikehold og vekst. Åpen kildekode programvare løsninger finnes for korreksjon av bevegelse i 2D over tid, gjennom bruk av StackReg og TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins i ImageJ eller Fiji, men disse kan ikke anvendes på 4D-datasett.
For å korrigere for prøven drift har vi utviklet en plug-in (Riktig 3D drift) for å utnytte open-source bildebehandling-prosessplattform, Fiji en. Vår plug-in er i stand til å utføre fasekorrelasjons registrering for å korrigere bevegelsen som oppstår som et resultat av prøven drift i tredimensjonale time-lapse eksperimenter. Fase korrelasjon 6 er en beregnings effektiv metode for å bestemme oversettelse mellom bildene. Den plug-in som er beskrevet her utnytter fase-korrelasjon bibliotek utviklet av Preibisch et al. 7. I multi-kanal eksperimenter, utnytter plug-in én kanal til fastsettelsenne den nødvendige korreksjon. Denne korreksjonen blir deretter påført noen ekstra kanaler som resulterer i registreringen av 4D datasett.
I sebrafisk modellsystemet er det mulig å utføre tidsforsinkelse avbildning over et tidsrom på flere timer eller til og med flere dager 8. En vanlig metode for montering av sebrafisk er å bygge inn den bedøvet levende embryo i lavt smeltepunkt agarose (0,8-1,5%), begrense bevegelsen 9-11. Mens bevegelsen er begrenset vekst av prøven alltid forekommer, noe som resulterer i at cellene innenfor synsfeltet skiftende stilling. For å følge bevegelsen av cellene i løpet av embryoet er det nødvendig først å korrigere for bevegelsen av hele prøven. Denne protokollen ble utviklet med sebrafisk eksemplarer, og har vært benyttet til bilde somitt utvikling 12, men kan brukes på alle 4D confocal datasett.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår evne til å bruke post-prosessering programvare for å rette prøven drift av datasett avledet fra lengre tid-lapse mikroskopi eksperimenter er begrenset av en rekke faktorer. Evnen til å skjelne drift versus trekkende bevegelse av en prøve er avhengig av de cellulære markører brukes. Cellular markører som enten er allment uttrykt i en prøve eller ikke er involvert i trekkende hendelser under bildet oppkjøpet gir den beste kilden for korreksjon av drifting. Det plugg bruker en enkelt kanal for å registrere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Gaby Martins og arrangørene av EMBO2010 3D Developmental Imaging workshop hvor dette arbeidet begynte og alle bidragsytere til Fiji og ImageJ prosjekter.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
