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Neuroscience

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Published: January 23, 2014
doi:
10.3791/51091
, , ,
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire,CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d’excellence,LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale,CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052,CNRS UMR 5286

Summary

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Abstract

Codetection célula individual de un gen, su producto de ARN y proteínas reguladoras celulares es fundamental para estudiar la regulación de la expresión génica. Este es un reto en el campo de la virología, y en particular para los virus de ADN persistentes nucleares-replicantes que involucran modelos animales para su estudio. Tipo de virus del herpes simple 1 (VHS-1) establece una infección latente de por vida en neuronas periféricas. El virus latente sirve como reservorio, de la que se reactiva e induce un nuevo episodio herpética. La biología de las células de HSV-1 latencia sigue siendo poco conocida, en parte debido a la falta de métodos para detectar HSV-1 genomas in situ en modelos animales. Se describe un ADN de hibridación in situ fluorescente (FISH) enfoque detectar de manera eficiente bajo número de copias de genomas virales dentro de las secciones de los tejidos neuronales de modelos animales infectados. El método se basa en el antígeno desenmascarar a base de calor, y las sondas de ADN caseras directamente etiquetados, o sondas disponibles en el mercado. Hemos desarrollado una triple staienfoque ning, combinando ADN-FISH con ARN-FISH e inmunofluorescencia, utilizando amplificación de la señal peroxidasa basado para dar cabida a cada requerimiento de la tinción. Una mejora importante es la capacidad para obtener, dentro de 10 micras secciones de tejido, las señales de baja fondo que se pueden obtener imágenes en alta resolución por microscopía confocal y de campo amplio de epifluorescencia convencional. Además, la triple tinción trabajó con una amplia gama de anticuerpos dirigidos contra proteínas celulares y virales. El protocolo completo tarda 2,5 días para dar cabida a anticuerpo y penetración de la sonda dentro del tejido.

Introduction

Tipo de virus del herpes simple 1 (VHS-1) es un virus neurotrópico humano persistente, establecer una infección latente a largo plazo en las neuronas de los ganglios del trigémino (TG) del sistema nervioso periférico, de la que se reactiva periódicamente para replicar y propagarse. El HSV-1 del genoma es un ADN de doble cadena 150 kb de localización en el núcleo de la neurona de acogida donde permanece plásmidos cromatinizados como multicopia, que no se integran en el genoma de la célula huésped 1,2. Durante la latencia, el programa genético de HSV-1 ciclo de replicación está fuertemente reprimida, y la expresión génica está restringida a la transcripción asociado a la latencia (LAT) locus, de establecimiento de latencia de la iniciación de la reactivación 3. LAT produce una larga 8,5 kb no codificante ARN procesado en un importante 2 kb lazo estable, y varios miARN 4-7. HSV-1 latencia se caracteriza, pues, por la presencia del ADN viral genómico, ARN LAT, y la ausencia de las proteínas del ciclo de replicación detectables.

ONTENIDO "> Los modelos animales, predominantemente de ratón y conejo, son modelos experimentales que recapitulan varias características de latencia en humanos. Uno de los principales intereses de esos modelos es que permiten estudiar los aspectos fisiológicos de HSV-1 latencia en huéspedes inmunocompetentes. Durante las últimas décadas , muchas herramientas experimentales, tales como virus y ratones modificados genéticamente, se han desarrollado para estudiar la fisiología, la genética y la biología celular de HSV-1 latencia, de tejidos animales. Hasta ahora, se detectó ADN genómico vírico y se cuantificó mediante Southern blot y qPCR de disociado TG. Sin embargo, actualmente no existe ningún método disponible para detectar el HSV-1 del genoma mediante hibridación in situ en secciones de tejido 8. En consecuencia, la latencia se evalúa rutinariamente en secciones histológicas a través de la detección de ARN LAT por ARN hibridación in situ en lugar de la detección del genoma viral. Debido a que ha sido imposible caracterizar las células infectadas basado en la presencia de genomas virales, this limitación técnica ha sido un inconveniente importante para el análisis de muchos aspectos de las interacciones huésped-virus, tales como la relación entre el genoma viral y la expresión génica celular y viral o la respuesta inmune mediada por células huésped 9,10.

Lo más importante, la heterogeneidad de célula a célula de la infección latente sigue siendo relativamente inexplorada y se ha demostrado que una característica clave de la latencia en ratones y en las neuronas ganglionares de la sensoriales humanos implantados en ratones SCID 11-17. Típicamente, se demostró por qPCR que el VHS-1 genoma número de copias por célula varía de 5 a varios cientos. Aunque LAT aparece como un regulador clave de la latencia y la reactivación, qPCR datos sobre las neuronas aisladas y PCR in situ indican que sólo un subconjunto de neuronas infectadas de forma latente, tan bajo como 30%, expresa el locus LAT 11,12,18-21. ¿Cómo la célula huésped y el entorno celular en el impacto de tejido sobre el establecimiento y la latencia del virusla expresión génica viral sigue siendo poco clara. Aquí se describe un fluorescente robusta de hibridación in situ (FISH) método para la detección eficiente de bajo número de copia VHS-1 DNA genómico dentro de las secciones de tejidos animales neuronales. Este método ha sido diseñado y utilizado por nosotros para tener acceso a imágenes de microscopía de alta resolución que es necesario estudiar la interacción del genoma viral con los componentes intra-nucleares de la célula huésped 22. Además, se describe un método de tinción múltiple para la detección simultánea del ADN viral con ARN y proteínas, que es una herramienta única para describir las interacciones virus-huésped que regulan la expresión génica viral. El método también se puede aplicar para una amplia gama de análisis que requieren la detección de HSV-1 del genoma latente, tales como la cuantificación de las neuronas infectadas en gran número de secciones. Un paso clave es aplicar el tratamiento de recuperación de antígeno para hacer el ADN viral accesibles a la hibridación. Por lo tanto, este protocolo también puede ser eficaz para la detecciónde otros virus de ADN de doble cadena, que en la actualidad no son detectables por métodos de DNA-FISH convencionales dentro de los tejidos animales.

Protocol

Este método se utilizó en un estudio publicado previamente 22. Para el fondo general y descripción de la manipulación convencional en ISH, IF y FISH, sugerimos la siguiente bibliografía disponible 23. 1. Infección Animal Todos los procedimientos con animales experimentales se ajustaban a las cuestiones éticas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en la investigaci…

Representative Results

Después de varios meses de extensas pruebas, descubrimos que desenmascarar química basada en el calor hizo latente HSV-1 genoma disponible para la hibridación fluorescente in situ. Durante el proceso, hemos intentado diversos procedimientos desenmascarar y tratamientos sólo en base al calor (es decir, el calentamiento de las secciones hasta la temperatura sub-ebullición en un horno de microondas) aparecimos eficiente. A continuación, prueba varios tampones de sal que se utilizan rutinari…

Discussion

El protocolo descrito aquí permite la detección de HSV-1 del genoma latente dentro de las neuronas de ratón secciones de tejidos neuronales. Nuestra comprensión de las vías que regulan la expresión de genes virales se ha visto limitado por la falta de método para detectar el HSV-1 ADN genómico in situ dentro de los tejidos neuronales. La información sobre el número de copias del genoma y la proporción de las neuronas infectadas provino principalmente de análisis de PCR en las neuronas disoc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a N. Sawtell (Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati, Cincinnati, Ohio, EE.UU.), S. Efstathiou (Universidad de Cambridge, Reino Unido) y James Hill (LSU Health Sciences Center, Nueva Orleans, EE.UU.) para proporcionar muestras de HSV-1 infectados con ratones y conejos, respectivamente, y para los reactivos; H. Masumoto (Instituto Kazusa DNA Research, Chiba, Japón) y S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Francia) útil para los debates.

Este trabajo fue financiado por becas del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (programa ATIP, PL, http://www.cnrs.fr), la Agencia Nacional Francesa de Investigación (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), la Fundación FINOVI ( http://www.finovi.org/:fr:start ), el Labex DEVweCAN (ANR-10-labx-61 ) de la Universidad de Lyon, en el programa "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) operado por la ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le Cáncer (ARC-7979 y ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), e Inca (programa EPIPRO, http://www.e -cancer.fr ). FC y PL son investigadores del CNRS.

Materials

Balb/c mice Janvier, France 6 week-old females
HSV-1 strains SC16 strain (wild type) See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride Sigma K2753 Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride Sigma X1251
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline Sigma 07982-100TAB-F
1X PBS, pH 7.4 (sterile) Life Technologies 10010-015
Sucrose Sigma 84100 Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS.
Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound – SAKURA 4583
Large vector DNA purification kit Qiagen 12462 To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C
Nick translation kit Roche Applied Sciences 10 976 776 001
Cy3-dCTP GE Healthcare PA53021 Protect from light
0.5M EDTA Sigma E6758
G50 Mini spin column GE Healthcare 27-5330-01
Salmon sperm DNA 10mg/mL Invitrogen / Life Technologies 15632-011
Ethanol molecular biology grade Sigma 87047 Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA Invitrogen / Life Technologies 15632-011
Formamid Molecular biology grade Sigma F9037 Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe Enzo Life Sciences ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
20X Saline Sodium Citrate (SSC) Sigma S6639 Prepare a 2X SSC solution in ddH20.
Triton X-100 Sigma T8787 Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use.
10mM sodium citrate pH 6.0 Sigma S1804 Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use.
Acetic Acid Sigma 320099
Methanol, molecular biology grade Sigma 322415
Dextran sulfate – MW 500 000 Euromedex EU0606-A
Denhardt's solution (100X) Euromedex 1020-A
Rubber Cement "FixoGum" Marabut 290110000
DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit – Qiagen 28104
T7 in vitro transcription kit Ambion / Life Technologies AM1314
Biotin-16-UTP Roche Applied Sciences 11388908910
RNA purification mini-column Qiagen 73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex New England Biolabs S1402S
H2O2 Sigma H3410 Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA Invitrogen 15401011 prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000
Primary antibodies Any supplier The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies Invitrogen / Life Technologies The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence) Invitrogen / Life Technologies #T20937 TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence) Invitrogen / Life Technologies #T20932
Hoechst 33342 Invitrogen / Life Technologies H3570 Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution.
22x50mm coverslip. n°1.5 glass. Electron Microscopy Sciences 72204-04
Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield – Vector Laboratories H-1000 Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science
Superfrost glass slides FisherScientific 12-550-15
EQUIPMENT
Equipment / material Company Reference Note
Needle for infection Glass micropipette hot drawn. Home made.
Dissection equipement Moria, France Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump Cole Palmer Instruments Easyload Masterflex
Micro-syringe pump device (Nano Pump) kdScientific KDS310
Cryostat Leica France CM 1510-1
-80 °C freezer Sanyo Ultra Low -80°C
Domestic microwave oven
Dry block heater Eppendorf 022670204
Incubator Slide moat Boekel Scientific 240000
Coplin Jar Dominique Dutscher 68512
Staining glass container Dominique Dutscher 68506
Fluorescent microscope Zeiss The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series

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References

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Catez, F., Rousseau, A., Labetoulle, M., Lomonte, P. Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining. J. Vis. Exp. (83), e51091, doi:10.3791/51091 (2014).
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