A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som.
Ortotópico xenografts câncer de bexiga são o padrão ouro para o estudo manipulações moleculares e celulares novos agentes terapêuticos in vivo. As linhas celulares adequadas são inoculados por instilação intravesical (modelo de crescimento invasivo nonmuscle) ou injecção intramural na parede da bexiga (modelo de crescimento invasivo). Ambos os processos são complexos e altamente consumidora de tempo. Além disso, o modelo superficial tem as suas limitações devido à falta de linhas celulares que são a seguir instilação tumorigénico. Injeção intramuros, por outro lado, é marcada pela invasão do procedimento e a morbidade associada para o mouse host.
Com estas limitações em mente, nós modificamos os métodos anteriores para desenvolver uma abordagem minimamente invasiva para a criação de ortotópico xenografts câncer de bexiga. Usando a orientação do ultra-som que temos realizado com sucesso inoculação percutânea das linhas celulares de cancro da bexiga UM-UC1, UM-UC3 e UM-UC13 em 50 nu atímico. Temos sido capazes de demonstrar que esta abordagem é tempo eficiente, preciso e seguro. Com esta técnica, inicialmente, é criado um espaço sob a mucosa da bexiga com PBS, e as células tumorais são então injectado para dentro deste espaço, em uma segunda etapa. O crescimento do tumor é monitorada em intervalos regulares com imagem de bioluminescência e ultra-som. Os volumes médios de tumor aumentou de forma constante nos em todos, mas um de nossos 50 ratos durante o período de estudo.
Em nossa instituição, esta nova abordagem, que permite a inoculação de xenotransplante câncer de bexiga, de forma minimamente invasiva, rápida e altamente precisa, substituiu o modelo tradicional.
Pesquisa sobre o câncer é dependente de modelos animais de câncer humano, usando linhas de células derivadas de tumores de pacientes, a fim de aprofundar a nossa compreensão da biologia do tumor. Pois na análise de crescimento vivo sob diferentes estratégias de tratamento de câncer de bexiga modelos murino ortotópico permanecer o padrão de referência 1,2. A inoculação de células de câncer de bexiga humanos em camundongos imunocomprometidos (modelo de xenotransplante) conta com a instilação intravesical ("modelo intravesical") 3,4,5 ou injeção direta na parede da bexiga ("modelo intramural") 6,7. Ambas as técnicas podem também ser realizadas em ratos 8,9.
Instilação intravesical induz a formação de tumores na superfície uroteliais de bexiga, que, em seguida, são passíveis de subsequente instilação intravesical de novos agentes de tratamento. No entanto, o número de linhas de células que são fiavelmente tumorigénicas quando entregues através deste método é limitado ad uma dessas linhas celulares, KU7, foi recentemente demonstrado ser HeLa 4,10. Instilação intravesical também é demorado devido ao tempo de espera necessários, e freqüentemente induz o crescimento do tumor em elementos adjacentes do trato urinário, incluindo uretra, ureter e pelve renal 11. Além disso, a instilação intravesical frequentemente conduz ao crescimento do tumor no chão da bexiga, onde os ureteres entrar na bexiga, e este pode causar a obstrução do tracto superior e insuficiência renal concomitante.
Xenoenxertos de cancro da bexiga invasivo primários que sejam adequados para tratamentos sistémicos são criados através de injecção directa de células tumorais na parede da bexiga 12. Apesar de numerosas linhas celulares de crescer adequadamente, neste modelo, a limitação é a capacidade de invasão do modelo relacionada com a necessidade de uma incisão abdominal 13. O modelo também é um desafio para aprender devido à dificuldade técnica de injeção de células precisamente na parede do músculoda bexiga.
Uma nova abordagem para estabelecer ortotópico primários xenografts câncer de bexiga invasivo em ratos foi desenvolvido em nosso serviço, a fim de colmatar as lacunas existentes do "modelo intramural". Nós fomos capazes de otimizar a, injeção percutânea guiada por ultra-som de células de câncer de bexiga na parede da bexiga anterior, resultando nesta nova técnica para substituir com sucesso o modelo invasivo estabelecida. Além disso, temos, potencialmente, aumentar a precisão e reprodutibilidade do "modelo intramural".
Quase todos os grandes avanços na terapia do câncer exigirá testes em modelos animais antes de iniciar os ensaios clínicos. Os modelos animais de câncer são ferramentas essenciais que permitem aos pesquisadores estudar a biologia do tumor in vivo. Modelos de xenoenxerto ortotópico permanecer padrão ouro 1,2 e continuar a oferecer o máximo de flexibilidade (em termos de seleção de linhagens de células) e têm a utilidade mais prática.
O procedimento ilustrado é uma modificação minimamente invasiva do modelo ortotópico previamente descrito por 12 Ðîññèÿ et al. Estabelecemos tumores xenoenxerto guiada por ultra-som injeção percutânea de três linhagens celulares diferentes, com uma taxa de sucesso técnico de 100%. Durante acompanhamento contínuo, 98% dos ratos demonstraram aumento constante no volume do tumor.
Ao realizar uma técnica minimamente invasiva, fomos capazes de lidar com as limitações existentes do modelo intramural. Além respecting bem-estar animal, a invasividade reduzida deste processo contribui também para a reprodutibilidade dos experimentos in vivo, pela diminuição do número de complicações cirúrgicas. É altamente eficaz do tempo para evitar uma laparotomia abdominal e necessidade associada para o fechamento da ferida. Fomos capazes de diminuir significativamente o tempo de procedimento por animal para 3,4 min (± 1,6). No entanto, a principal vantagem da nossa nova abordagem é a sua precisão. De alta resolução ultra-sons permite visualizar o espaço criado pela injecção de solução salina sob a mucosa da parede da bexiga. Este primeiro passo de injecção facilita a injecção de células de tumor, num segundo passo e minimiza o risco de derramamento de células de tumor. Isto contrasta com a técnica de injeção intramural após laparotomia, onde é impossível visualizar a colocação da agulha e há sempre um elemento de incerteza em relação à profundidade exata da injeção. Além disso, como estamos a inoculação de células tumorais estritamente na parede da bexiga anterior, growt tumorh na parede posterior da bexiga é evitada. Subsequentemente, a taxa de complicações obstrutivas devido ao crescimento do tumor na proximidade dos orifícios ureterais é extremamente rara. Este efeito permite que acompanha os períodos de crescimento e de tratamento mais longos.
A principal limitação da inoculação do tumor guiada por ultra-som é a necessidade de equipamento técnico adequado. Por conseguinte, o desempenho deste procedimento será provavelmente restrita aos centros que são especializados em modelos animais de cancro humano. Isto deve encorajar a colaboração entre grupos de pesquisa fora dessas instituições e os grupos com experiência em modelagem, tais animais romance.
Embora dependente da familiaridade com ultra-sonografia e alguma destreza manual, este modelo é fácil de aprender sob a instrução competente. O passo chave no processo é a criação de um espaço artificial submucosa da parede da bexiga com solução salina. Uma vez que este espaço é criado sem perfuração of a camada mucosa, que permanece estável durante vários minutos. A orientação da segunda agulha para dentro deste espaço, a fim de inocular as células tumorais são relativamente simples. A principal complicação durante a criação do espaço submucosa é a perfuração da agulha para dentro do lúmen da bexiga. A criação de um espaço na submucosa, no entanto, continua a ser viável. A agulha tem de ser retirada lentamente para dentro da parede da bexiga e da solução salina injectada apenas quando a camada mucosa vira a ponta da agulha. Após esta manobra, o espaço submucosa é menos estável (solução salina escorra para dentro do lúmen da bexiga 30-60 seg) e a injecção de células de tumor tem de ser realizado rapidamente. O derramamento de células de tumor para dentro do lúmen da bexiga podem ocorrer nestes casos com a perfuração da mucosa. Embora a perda de células tumorais a partir do espaço intramuros pode levar a uma diminuição do volume do tumor durante o seguimento, nós nunca ter observado qualquer captação tumoral intravesical.
Outro potencial complication é o derramamento de células tumorais para a cavidade peritoneal através do canal de injecção. Observou-se apenas uma disseminação de células tumorais intraperitoneal em 50 animais, e isso ocorreu em uma de nossas primeiras tentativas. Atribuímos isso à injeção de um volume demasiado importante suspensão de células do tumor. Isto foi corroborado pelo facto de que a redução do volume de 50-40 mL resultou em não mais derramamento intraperitoneal.
Esta inoculação minimamente invasivo de murino ortotópico xenotransplante câncer de bexiga representa uma modificação inovadora do "modelo intramural" existente, beneficiando tanto o investigador e os animais da mesma forma. As vantagens deste modelo de encorajar a sua adaptação a outros órgãos, tais como rim, próstata e fígado, a fim de estabelecer tumores de xenoenxerto ortotópicos de uma forma minimamente invasiva.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer Eliana Beraldi para a realização de transdução viral de linhagens de células tumorais e Ben Deeley para sua instrução sobre o uso do pequeno animal plataforma ultra-sonografia.
Este projecto foi apoiado pelo Sistema Alemão Foundation (DFG; JA 2117/1-1: 1), o Instituto de Pesquisa Canadian Cancer Society e uma Mentored Médico Scientist Award de Vancouver Coastal Research Institute Health. A plataforma ultra-sonografia foi financiado pela Fundação Canadense para Inovação.
Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
IVIS Lumina III | Caliper Life Science |