लाइव सभ्य न्यूरॉन्स के एंटीबॉडी खिलाने के बाद सेल सतह और भली भाँति प्रोटीन का अंतर लेबल
Summary
हम एक विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी कोशिकी epitopes के लिए उपयोग कर न्यूरॉन्स रहने की सतह पर प्रोटीन लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन. कोशिका की सतह पर एंटीबॉडी से बंधे और बाद में endocytosis के माध्यम से भली भाँति प्रोटीन प्रोटीन पर शेष से प्रतिष्ठित, या ऊष्मायन के दौरान सतह के लिए अवैध व्यापार किया जा सकता है.
Abstract
सभ्य न्यूरॉन्स में एक ख्यात transmembrane रिसेप्टर की सेल सतह स्थानीयकरण का प्रदर्शन करने के लिए, हम प्रोटीन की एक बाह्य भाग खिलाफ उठाए गए एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लाइव न्यूरॉन्स की सतह पर प्रोटीन लेबल. कोशिकाओं निर्धारण के बाद फिर सेल सतह और आंतरिक प्रोटीन दोनों एक ही लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाएगा permeabilized रहे हैं रिसेप्टर्स, सतह के लिए और से तस्करी कर रहे हैं कि यह देखते हुए. यहाँ, हम या तो कोशिका की सतह पर बने रहे या इस अवधि के दौरान सतह के लिए तस्करी कर रहा था कि एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम और प्रोटीन के दौरान endocytosis से भली भाँति किया गया था कि लेबल प्रोटीन विभिन्न करने के लिए प्रोटीन की तस्करी ("एंटीबॉडी खिला") का अध्ययन करने की विधि अनुकूलित . प्रोटीन की इन दो पूल भेद करने की क्षमता एक प्रारंभिक incubatio के बाद अत्यधिक केंद्रित unlabeled माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक रात अवरुद्ध कदम के समावेश के माध्यम से संभव बनाया गया थाएक fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ unpermeabilized न्यूरॉन्स के एन. एक अलग fluorophore साथ लेबल एक फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ भली भाँति पूल का पता लगाने की अनुमति दी न्यूरॉन्स के अवरुद्ध कदम, permeabilization के बाद. हम यह था कि खुलासा, इस ख्यात रिसेप्टर के subcellular स्थान के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने में सक्षम थे इस तकनीक का उपयोग, वास्तव में, न्यूरॉन्स में सेल सतह को तस्करी. इस तकनीक को एक बाह्य मिलान करने के लिए एक उपयुक्त एंटीबॉडी प्रदान करने, सेल प्रकार और सेल सतह प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए मोटे तौर पर लागू है उपलब्ध है.
Introduction
नव पहचान प्रोटीन के समारोह की स्थापना में, सवाल में प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण और तस्करी की जांच प्रोटीन 1,2 की संभावना भूमिका / एस के बारे में महत्वपूर्ण सुराग दे सकता है. विकासशील neocortex 3 के transcriptome की पहले से पंजीकृत विश्लेषण माउस मस्तिष्क corticogenesis के दौरान बदल अभिव्यक्ति का प्रदर्शन जीन की एक सूची के साथ हमें प्रदान की है. हम तो इन जीनों में से एक, sez6 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन, न्यूरॉन विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका है कि पता लगाने के लिए एक जीन पीटा दृष्टिकोण अपनाया. हम जब्ती से संबंधित जीन 6, या Sez6, प्रोटीन के विकास डेन्ड्राइट में स्थित और भी वृक्ष के समान spines, प्राप्त और उत्तेजक संकेत है कि एकीकृत डेन्ड्राइट पर विशेष संरचनाओं में मौजूद है कि मनाया. इस प्रोटीन की कमी है इसके अलावा, जब डेन्ड्राइट और उत्तेजक synapses सही ढंग से 4 फार्म असफल. प्रोटीन की संभावित प्रमुख isoform एक transmembran की विशेषताएं हैई रिसेप्टर immunolabeled प्रोटीन की subcellular वितरण confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा या immunoelectron माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी जब, हालांकि ज्यादातर, नहीं तो सब, संकेत के प्लाज्मा झिल्ली पर लेबल थोड़ा, या नहीं, प्रोटीन के साथ somatodendritic डिब्बे में छोटे vesicles के साथ जुड़ा हुआ दिखाई दिया कोशिका की सतह पर.
निश्चित एक भविष्यवाणी की बड़ी बाह्य डोमेन के साथ इस ख्यात रिसेप्टर प्लाज्मा झिल्ली में अवैध है कि दिखाने के लिए, हम हम कोशिका की सतह पर प्रोटीन लेबल करने के लिए प्रोटीन का एक बाह्य भाग को उत्पन्न किया था सीरमरोधी का उपयोग कर एक जीवित कोशिका दृष्टिकोण अपनाया. एक व्यापक अवरुद्ध कदम और एक permeabilization कदम से अलग कर विभिन्न लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के दो अनुप्रयोगों के साथ इस "एंटीबॉडी खिला" दृष्टिकोण के संयोजन से, हम fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी अलग fluoresc असर के बंधन से प्रतिष्ठित प्रोटीन की दो अलग ताल की पहचान करने में सक्षम थेईएनटी टैग. इस प्रकार, हम या तो कोशिका की सतह पर बने रहे या इस अवधि के दौरान सतह के लिए तस्करी कर रहा था कि प्रोटीन से एंटीबॉडी ऊष्मायन चरण के दौरान endocytosis से भली भाँति किया गया था कि प्रोटीन भेद करने में सक्षम थे. इस पद्धति का उपयोग करके, हम ब्याज की प्रोटीन न्यूरॉन्स में कोशिका की सतह के लिए और से तस्करी कर रहा है कि स्थापना की. इसलिए, यह अपेक्षाकृत तेज और आसान तकनीक हम सभी इन तकनीकों के लिए एक ही खरगोश पॉलीक्लोनल सीरमरोधी प्रयोग किया जाता है कि इस तथ्य के बावजूद पारंपरिक immunocytochemistry तरीकों या पूर्व embedding immunogold इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से अधिक जानकारीपूर्ण साबित कर दिया. इस तकनीक कोशिकी डोमेन epitopes पहचानने एक अच्छा प्रतिरक्षी उपलब्ध है प्रदान की किसी भी transmembrane प्रोटीन के लिए आम तौर पर लागू है. तकनीक ग्लूटामेट रिसेप्टर GluR1 सबयूनिट 5 रिसेप्टर तस्करी का अध्ययन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित तकनीक (द्वारा Arancibia-Carcamo एट अल. समीक्षा) सेल सतह biotinylation 12 की है कि पूरक है और यह भली भाँति प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण के बारे में जानकारी के संरक्षण के लिए पसंद की विधि है, एक उपयुक्त प्राथमि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के आंकड़ों के साथ सहायता के लिए Teele Palumaa धन्यवाद. राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ऑस्ट्रेलिया से परियोजना अनुदान 1008046 द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
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