فرز<em> المتسلسلة</em> الكريات الخلية باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز
Summary
وتتميز الثقافات المتسلسلة نابعة من السائل بواسطة الكريات أفطوري التي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والفرز مثل الكريات بطريقة عالية الإنتاجية. هذه الكريات يمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات، التي ستوفر يؤدي إلى فهم والسيطرة على تجانس النمو.
Abstract
Streptomycetes هي البكتيريا الخيطية التربة التي تستخدم في الصناعة لانتاج الانزيمات والمضادات الحيوية. عندما نمت في المفاعلات الحيوية، وهذه الكائنات تشكل شبكات من خيوط مترابطة، والمعروفة باسم الكريات، والتي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والكريات أفطوري الفرز باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز (COPAS). يتم إعطاء تعليمات مفصلة للاستعمال الصك والتحليل الإحصائي للبيانات الأساسية. وصفنا وعلاوة على ذلك كيف يمكن فرز الكريات وفقا للإعدادات المعرفة من قبل المستخدم، والتي تمكن معالجة المصب مثل تحليل الحمض النووي الريبي أو محتوى البروتين. باستخدام هذه المنهجية يمكن معالجتها آلية النمو غير متجانسة الأساسية. وسوف يكون هذا مفيدا لتحسين streptomycetes كما ومصنع الخلية، نظرا لكون الإنتاجية يرتبط حجم بيليه.
Introduction
Streptomycetes هي البكتيريا الخيطية التربة التي هي معروفة جيدا لكفاءتهم لجعل المضادات الحيوية، وكذلك المركبات التي يمكن استخدامها بوصفها مناعة أو لمكافحة العدوى الفطرية أو 1،2 السرطان. بالإضافة إلى ذلك، هذه الكائنات تنتج الأنزيمات التي تهم لمجموعة واسعة من التطبيقات الصناعية 3. ويتم إنتاج معظم هذه المركبات للاهتمام تجاريا في المفاعلات الحيوية. ويتميز نمو streptomycetes في المفاعلات الحيوية عن طريق تشكيل هياكل معقدة من خيوط مترابطة، والمعروفة باسم كتل أو حبيبات. هذه الهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة للغاية فيما يتعلق بحجم 4 ويمكن أن تصل إلى الأحجام التي هي أكثر من مليون مرة أكبر من البكتيريا وحيدة الخلية مثل الإشريكية القولونية أو العصوية الرقيقة. على الرغم من أن يعتبر عدم التجانس كصفة مفيدة في النظم البيولوجية الطبيعية 5، فهو يعتبر شرك الإنتاج في الصناعة. الحيويالزراعات مفاعل يجب أن تكون قابلة للتكرار ويمكن السيطرة عليها للحصول على أعلى العوائد الممكنة. وبالتالي، فإن فهم مفصل لدور كل نوع من أنواع بيليه في مفاعل حيوي هو أمر حاسم لتحسين streptomycetes كما ومصنع الخلية.
التدفق الخلوي يستخدم عادة لتحليل الخلايا الفردية في عدد السكان 6. يمكن الحصول على معلومات أجهزة قياس التدفق الخلوي multiparametric عن طريق قياس الخصائص في وقت واحد من الخلايا (مثل الحجم، والكثافة، ومتعدد الألوان مضان). في هذه الطريقة، خصائص الخلية يمكن ربط مما يسهم في فهمنا لعدم التجانس داخل ثقافة ووجود السكان متميزة من الخلايا 6. جعلت أدوات أكثر تخصصا من الممكن لفرز الخلايا وفقا لمعايير المعرفة من قبل المستخدم. على سبيل المثال، يمكن فحص المسوخ. بعد الفرز، مثل خلايا متحولة يمكن زراعتها لمزيد من التوصيف. وقد ثبت هذا بالفعل أن تكون مفيدة، من بين أمور أخرى،لتحسين إنتاجية سلالات 7،8. الفتحات من أجهزة قياس التدفق الخلوي تسمح عادة لمرور الخلايا التي يبلغ قطرها القصوى من ما يقرب من 10 ميكرون. وبالتالي، الكريات من streptomycetes لا يمكن تحليلها مع أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية. هم، ومع ذلك، يمكن تحليلها مع كائن مجمع حدودي محلل وفارز (COPAS). مثل أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية، ويمكن الحصول على البيانات COPAS multiparametric الجسيمات بطريقة إنتاجية عالية. اعتمادا على نوع من COPAS يمكن تحليلها 10-1،500 ميكرون الحجم. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح للفرز من الجزيئات الفردية التي يمكن استخدامها للزراعة أو التحليلات المصب، مثل عزل DNA، RNA، أو البروتينات. وقد تم تصميم COPAS البداية لتحليل وفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة، مثل الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس 9، والأجنة واليرقات ذبابة الفاكهة 10. كما تم استخدام الصكوك لالزرد 11 لالثانية للفطريات خيطية 12،13. كما تشكل الكائنات الحية الأخير الكريات أفطوري التي هي أكبر من تلك التي شكلتها البكتيريا الخيطية. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن استخدام COPAS هي أيضا مجدية لstreptomycetes 4. نحن هنا وصف الإجراء التجريبي لاستخدام COPAS لتقييم بيليه عدم التجانس في المتسلسلة coelicolor، بما في ذلك تفاصيل عن منهجية لفرز وفقا لحجم الكريات. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل أخرى streptomycetes تشكيل بيليه.
Protocol
Representative Results
Discussion
التدفق الخلوي وقد مكن تحليل عالية السرعة أعداد كبيرة من الخلايا واحد، الأمر الذي ساهم في فهمنا لعدم التجانس في السكان نسيلي 6. العادية التدفق الخلوي ليست مجدية لتحليل الكريات أفطوري متعددة الخلايا من streptomycetes والفطريات. وقد أظهرت عملنا أن تحليل الإنتاجية العالية من الكريات المتسلسلة هو ممكن باستخدام COPAS. الإجراء المذكورة هنا هي بسيطة وسريعة، وقابلة للتكرار للغاية. المعلمة الحرجة أن نأخذ في الاعتبار أثناء تشغيل الأداة هي سرعة تدفق، والتي يجب أن لا تتجاوز 100 الأحداث / ثانية (3.8 خطوة من هذا البروتوكول). إذا كان تركيز بيليه، وبالتالي أيضا سرعة التدفق، ويصبح عالية جدا، وسوف أخطأت القيم TOF بسبب فشل أداة للكشف عن الكريات الفردية. تمييع العينة بما فيه الكفاية من خلال إضافة برنامج تلفزيوني يتغلب على هذه المشكلة.
القيود
استخدام COPAS بلس د هنا له فوهة قطرها من 1 ملم، الذي هو مناسبة لقياس الجسيمات مع حجم تتراوح 30-700 ميكرون. ولهذا يمكن قياس فوهة الكريات التي شكلتها streptomycetes. في حالة الفطريات الخيطية قد تكون المستعمرات الصغيرة أكبر، مما يحد من مدى انطباق العام للCOPAS زائد. وCOPAS XL يمكن قياس الجسيمات يصل إلى 1،500 ميكرومتر في الحجم ولكن حساسيتها في نطاق أقل من قطرها أقل مقارنة بما كان عليه من COPAS زائد. كل من COPAS زائد وCOPAS XL لا يمكن تحليل جسيمات أصغر من 30 ميكرومتر. هذا يعني أن الجراثيم الميكروبية أو الخلايا الفردية لا يمكن تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، قد لا COPAS تحليل بدقة المجاميع الصغيرة من الجراثيم والخلايا أو المستعمرات الصغيرة الصغيرة جدا. لهذا، يجب استخدام تحليل الخلايا العادية. يتم التغلب على هذا القيد من قبل Biosorter من الاتحاد Biometrica، والتي يمكن تحليل الجزيئات في مجموعة من 1-1،500 ميكرون. لكن الجائزة الشراء هو أعلى من ذلك.
وCOPAS هو أداة قوية التي من السهل أن تعمل. ومع ذلك، وأحيانا لا يتم الكشف عن الكريات بعد تحميل عينة في الكأس العينة والبدء في القياس. السبب هو عادة أنبوب دخول انسداد، والتي يمكن بسهولة أن تحل عن طريق الضغط على القيادة 'نظيفة'. وهذه القوة الكريات مرة أخرى من نظام أنابيب في الكأس العينة. قد يكون السبب البديلة التي لا غطاء وضعها بشكل صحيح على الكأس العينة. وهذا يؤدي إلى فقدان الضغط والفشل المصاحبة للكشف عن الكريات.
أهمية والاتجاهات المستقبلية
ركزنا هنا على تحليل حجم بيليه ولكن الإعداد COPAS هي أيضا قادرة على تحليل والفرز على أساس مضان والكثافة. الكشف عن مضان تمكننا من تحليل التعبير الجيني على أساس صحفيين مثل GFP. علاوة على ذلك، يمكن تقييم تكوين الخلايا. أكثر قوة هو الخيار لفصل الكريات وفقا لهذه parameالنسب. فرز الكريات يمكن استخدامها لتحليل المصب، بما في ذلك جميع OMICS-الدراسات. في الواقع، ونحن فرزها سابقا 60،000 الكريات الكبيرة والصغيرة 200،000، وأثبتت أن بروتيوم كانت مختلفة بشكل ملحوظ بين الكريات الكبيرة والصغيرة 4. وبالتالي توفر هذه التكنولوجيا خيوط جديدة لتحسين streptomycetes كمصانع الخلية.
الميزة الأساسية لتكنولوجيا COPAS هو الوقت. أجريت الدراسات السابقة على الكريات الخلايا باستخدام المجهر، وهذا يحد من عدد الكريات التي يمكن تحليلها تصل إلى عدة مئات 16. اقترحت الدراسات المجهري بالفعل وجود اثنين من السكان من الكريات في نمت السائل المتسلسلة الثقافات 16. في الواقع، تم الكشف عن اثنين من سكان كريات بغض النظر عن الظروف والثقافة في عدد كبير من streptomycetes مختلفة 4. لا يقتصر هذا الحجم إلى عدم التجانس streptomycetes الخيطية، ولكن لوحظ أيضا في الفطريات الخيطية 12 </ سوب>. في جميع الحالات، والآليات الكامنة وراء عدم التجانس ليست معروفة حتى الآن. إمكانية فرز الكريات وفقا لحجم ومضان تمكننا من كشف مثل هذه الآليات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
References
- Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
- van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
- Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
- van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
- Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
- Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
- Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
- van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
- Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
- Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).
