Summary
Målinger av nervelednings eiendommer i vivo eksemplifisere et kraftig verktøy for å karakterisere ulike dyremodeller av nevromuskulære sykdommer. Her presenterer vi en enkel og pålitelig protokoll hvorved elektro analyse på sciatic nerver av anesteserte mus kan utføres.
Abstract
Elektrofysiologiske studier tillater en rasjonell klassifikasjon av forskjellige nevromuskulære sykdommer, og er til hjelp, sammen med neuropatologiske teknikker, i forståelsen av patofysiologien 1.. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å utføre elektrofysiologiske studier på mus sciatic nerver in vivo.
Dyrene ble bedøvet med isofluran, for å sikre analgesi for de testede mus og uforstyrret arbeidsmiljøet under målingene som tar omtrent 30 min / dyr. En konstant kroppstemperatur på 37 ° C opprettholdes ved en varmeplate og kontinuerlig målt av en rektal termo probe 2. I tillegg er et elektrokardiogram (EKG) rutinemessig registrert under målingene for å kontinuerlig overvåke den fysiologiske tilstand av de undersøkte dyr.
Elektrofysiologiske opptak er utført på isjiasnerven, den største nerve av the perifere nervesystemet (PNS), forsyne musa hind lem med både motoriske og sensoriske fiber traktater. I vår protokoll, sciatic nervene er fortsatt på stedet og derfor ikke trenger å bli hentet eller utsatt, slik at mål uten noen negative nerve irritasjoner sammen med faktiske innspillinger. Ved hjelp av egnede nålelektroder tre vi utfører både proksimale og distale nerve stimulering, registrere de overførte potensialer med sensing elektroder på gastrocnemius muskler. Etter databehandling, pålitelig og meget ensartede verdier for nerveledningshastigheten (NCV) og forbindelsen motor aksjonspotensialet (CMAP), de viktigste parametre for kvantifisering av total perifer nerve fungerer, kan oppnås.
Introduction
Elektrofysiologiske målinger er et uunnværlig verktøy for å undersøke den funksjonelle integritet av perifere nerver i både klinisk og laboratoriemiljøer. Hos mennesker er en lang rekke nevromuskulære lidelser og nevropatier diagnostisk avhengige elektrofysiologiske målinger. Ved å måle nerve egenskaper som ledningshastigheten eller mulige amplituder av signalet, er det mulig å karakterisere den grove opprinnelse perifere nervesykdommer.
Den nerve ledningshastigheten er svært avhengig av rask signal forplantning aktivert som myelinisering. Derfor, demyeliniserende prosesser generelt viser redusert ledningshastigheter fire. Den sammensatte motor aksjonspotensial (CMAP) - korrelere med antallet funksjonelle axoner - er en indikator for aksonal skade når betydelig redusert 5.
Således, ved hjelp av elektrofysiologiske metoder etiologien av perifer nerveskadekan diskrimineres, slik som for arvelige neuropatier 6,7, diabetisk nevropati 8,9, kronisk inflammatorisk demyeliniserende polynevropatier (CIDP) 10 eller metabolske neuropatier 11.
Normalt, i human anvendelse noninvasive opptak på Sural eller ulnar nerve er foretrukket. Hos mus, er det enkelt å analysere nerve egenskaper sciatic nervene, den største nerve i det perifere nervesystemet (PNS) som inneholder både store - og små-kaliber axons av motorisk og sensorisk system.
Prosedyren som demonstrert her er en rask, enkel og pålitelig metode for å måle alle standardverdiene relevante for elektrofysiologi på perifere nerver i den intakte mus. Ved å ta opptak fra en konservert organisme, blir fysiologiske tilstander i nerve miljø garantert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til beskyttelse av dyr loven av Forbundsrepublikken Tyskland (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) og ble godkjent av Thüringer State Office for mattrygghet og forbrukervern (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
En. Sette opp Målinger
- Anesthetize mus ved isofluran / O 2 inhalasjon - for start av anestesi 3%, for vedlikehold 2% isofluran i 100% oksygen (figur 1). Bekreft tilstrekkelig anestesi ved å teste enkle reflekser som bevegelse reflekser og testing av følsomhet for lav grad av smerte. Bruk av salve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi er anbefalt, men ikke uunnværlig fordi prosedyren tar vanligvis bare 30 min / dyr totalt. I tilfelle av overlevelses eksperimenter, administrere betimelig lenger virkende analgetika for håndtering postoperative smerter.
- Barbere pelsen dekker baklemmene med en elektrisk barbermaskin og utføre hårfjerning med en kommersielt tilgjengelig hår-fjerning krem mens dyr er allerede under analgesi. For å opprettholde patogen-fri status gjennom hele prosedyren, slitasje aseptiske hansker og alltid bruke instrumenter nøye rengjort med 70% etanol.
- Kontroll kroppstemperaturstabilitet ved en tilbakemelding styrt varmeplate og rektal thermo probe (figur 2). Hvis nødvendig, kan du bruke en steril drapere å dekke varmeplate mellom dyrene for å holde en steril eksperimentelle miljøet. Videre er det anbefalt å bruke en varmeplate, som er elektronisk styrt ved hjelp av en integrert sensor for å begrense oppvarmingstemperaturen til ≤ 40 ° C for å unngå vevsskade.
Figur 1. Experimental oppsett som viser en bedøvet mus med barbert baklemmene. - Ta EKG (elektrokardiogram) opptak for å overvåke hjertefrekvensen som en viktig parameter. Sett tre elektroder for EKG-registreringer som følger: en elektrode under huden av hver forbena og en elektrode under huden i nakken.
- Place ring elektroder som bruker kontakt gel for optimal konduktivitet / overgangsmotstand. Den sensing elektrode (merket med svart) er plassert i posisjonen der gastrocnemius muskelen har sitt maksimum diameter. Den referanseelektrode (vist i rødt) er plassert like under føleelektrode.
Merk: Se "Material tabell 'for utstyr detaljer. - Markere de riktige posisjonene til måling med forhåndsbestemte, men konsekvent avstand mellom proksimale og distal isjiasnerven stimulering og ledelsen elektroden. Eksperimentell forslag: I en avstand på 4 mm fra føleelektrode, blir den distale stimulering finner sted.I en avstand på 16 mm til føleelektrode, vil den proksimale stimulering utføres (figur 2).
Figur 2. Representative bilde som viser den eksperimentelle situasjonen like før begynnelsen av målingene. Den hvite pilen indikerer posisjonen av føle (sort) og referanse (rød) elektrode ved gastrocnemius muskel i venstre bakben lem. Stimulering av nålelektroder vil bli utført ved definerte posisjoner i forhold til den sorte føleelektrode. Poenget med distal stimulering (svart merke med "DS" på venstre hind lem) har en avstand på 4 mm fra sensing elektrode; plassen til proksimale stimulering (svart merke med "ps") er 16 mm unna. Den røde linje på høyre bakben lem viser omtrent iMate anatomiske løpet av isjiasnerven. Videre er de grove posisjonene til relevante hind lem muskler vist som landemerker. Stjernen indikerer endetarms termisk sonde.
2. Måling
- Prinsipp: Utfør en rekke nervestimuleringer med gjentatte genererte enkelt square-wave pulser på 0,1 ms varighet ved monoengangs 28 G nålelektroder (repetisjon rente 200 msek, se figur 3A). For off-line-analyse av data, er det anbefalt å samtidig skaffe stimuleringssignaler sammen med neuromuskulær funksjon responskurven (figur 3B) på grunn av nervestimulering. Gjennomsnittlig en serie av maksimal respons ("representative neuromuskulær funksjon response") for etterfølgende dataanalyse. For å produsere pålitelige data, spille inn og senere gjennomsnittlig minst tre uavhengige, optimale responskurver pr stimulering området og dyr.
p_upload/51181/51181fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
Fig. 3. Fremgangsmåte for innsamling og analyse (skjematisk presentasjon). Blir gjentagelser genererte pulser påføres hoftenervene via nålelektroder (øverste rad i figur 3A). Samtidig er en rekke tilsvarende nevromuskulær responskurver registrert (nedre linje i figur 3A). Når gjennomsnitt og forstørret, nevromuskulære responskurvene på grunn av stimulering pulser (øverste rad i figur 3B) viser de følgende karakteristiske egenskaper (nederste rad på figur 3B): ventetid av signalrespons, så vel som varighet og amplitude av signalet, er angitt og kan fås for etterfølgende beregninger og statistikk. Uregelmessig signalledning og / eller suboptimale innspillinger vanligvis resultere i forskjellige signal deformasjoner med mer enn bare én positiv og én negativ nedbøyning eller signal deformasjon(Bimodal form) med redusert amplitude (Figur 3C). - Utfør proksimale stimulering med en nål-elektrode ved bestemt posisjon ("PS" i figur 2).
- For å oppnå de beste opptaksforhold med maksimale amplituder, visualisere de faktiske responskurvene samtidige til stimuleringsprosessen. Ved å gjøre dette, er det experimenter kunne vurdere umiddelbart formen på responskurvene så vel som størrelsen av amplituden.
- Hvis det er nødvendig, lett og nøye manipulere posisjonen og / eller vinkelen til stimulering nålen i forhold til hoftenervene. Denne milde optimalisering av stimuleringsbetingelser gjør det mulig å nå frem konstante amplituder med en størst mulig verdi og en responskurve for typiske bifasisk form (figur 4).
- Utfør distal stimulering med en nål-elektrode ved bestemt posisjon ("ds" i figur 2).
- Etter completion av målingen, overføre testet musen til et eget bur til den har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke la et dyr uten tilsyn og i selskap med andre dyr før det er fullt restituert fra anestesi. Administrer betimelig lenger virkende analgetika for håndtering postoperative smerter. Systemisk administrasjon av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs) og opioider anbefales for 1-3 dager.
- Alternativt ofre fortsatt bedøvet mus på en rask og human måte uten ytterligere smerte for dyret, for eksempel ved halsen forvridning.
Figur 4. Illustrasjon å bestemme CMAP innspillinger med maksimale amplituder. En fullstendig registrering serien er presentert. (A (B) svak stimulering nål bevegelse resulterer i CMAP innspillinger med maksimale amplituder. (C) Andre endringer i nål plassering produsere CMAP innspillinger med forskjellige amplituder inkludert nesten maksimal amplituder. (D) Stimulering nål erstatning med serie CMAP opptak av nær-maksimale amplituder. Merk: Typisk minsk i CMAP amplituder kan oppstå under repeterende stimulering på optimal stimulering side 12, 13. Stjernene indikerer CMAP innspillinger med maksimale amplituder avbildet for gjennomsnittsberegning.
Tre. Analyse
- Pakk nervelednings parametere basert på representative nevromuskulær funksjon respons datasett ved hjelp av en passende programpakke (f.eks AtisaPro).
Merk: Vennligst håndtere tidsrelaterte data besluttsomhet med spesiell omsorg fordi vendepunkt fastsettelse av kompoundmotor handling pottenential (CMAP) utbruddet og oppsigelse kan være vanskelig. En prosedyre med verifisert reproduserbarhet er gitt i Figur 3B, hvor tangentene på signal nedbøyninger etter utbruddet, og før oppsigelse blir brukt. - Beregn 'signal latency' og 'CMAP' verdier.
- Ventetid 'representerer tidsforsinkelsen mellom stimulering og CMAP utbruddet, mens tidsrommet mellom CAMP utbruddet av første negative utslag til innledende tilbake til baseline kalles' CMAP varighet '. Bruk forskjellen mellom de distale og proksimale ventetider for å beregne ledningshastigheten sammen med avstanden mellom de distale og proksimale stimuleringssteder.
ledningshastighet = latency / avstand mellom stimulering sider - CMAP '(forbindelse motor aksjonspotensial) amplitude representerer størrelsen mellom maksimale positive og negative behandlingstid punktet for CMAP signal (gitt i mV).
CMAP = verdi 'positiv snuoperasjon punkt' - verdi 'negative snuoperasjon point '
- Ventetid 'representerer tidsforsinkelsen mellom stimulering og CMAP utbruddet, mens tidsrommet mellom CAMP utbruddet av første negative utslag til innledende tilbake til baseline kalles' CMAP varighet '. Bruk forskjellen mellom de distale og proksimale ventetider for å beregne ledningshastigheten sammen med avstanden mellom de distale og proksimale stimuleringssteder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi gjennomførte en serie av in vivo elektrofysiologiske målinger på sciatic nerver av 12 mus totalt for denne studien: 6 dyr av hvert kjønn. Målingene ble utført med den fremlagte protokoll og levert følgende resultater:
Både hann-og hunnmus viser en bety isjiasnerveledningshastighet på omtrent 20 m / sek (figur 5). Dette er i tråd med andre målinger i litteraturen. Videre viser det at det ikke finnes relevante forskjeller i nerveledningshastighet mellom menn og kvinner i henhold til våre data.
Figur 5. Nerveledningshastigheter av isjiasnerven målt for mannlige og kvinnelige mus in vivo.
Figur 6. CMAP amplituder etter proksimale (lilla) og distal (rød) stimulering av isjiasnerven in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokollen gir en enkel og pålitelig metode for å bestemme sciatic nerve conduction egenskaper på bedøvet mus uten behov for å eksponere nerve av interesse. Likevel, denne eksperimentelle prosedyren fører vevsskade ved nålestikk. Det er derfor et rimelig alternativ til å ofre dyrene etter å ha avsluttet opptakene. Men, er vevsskade relativt svak, 3,14 i forhold til andre mer invasive prosedyrer som krever eksponering av nerve før opptak. Derfor gjentatte målinger er mulig, og er avhengig av utformingen av den aktuelle undersøkelse. Men enkelte punkter må vurderes for å sikre konsistente resultater.
For å utføre optimal opptaksforhold, er det viktig å redusere hudens motstandsdyktighet ved fullstendig hårfjerning, omfattende rengjøring av huden, og ved hjelp av kontakt gel, som alle muliggjør en hensiktsmessig lavt støynivå / forurensning under meaaging.
Videre er det viktig å se for optimale, bifasiske kurveformer for de detekterte signaler, som vist i figur 3B. Av og til, vi også oppdage kurver som er åpenbart et produkt av uregelmessig signalledning gjennom antidrome signal spredning eller ved noen nerve grener. Denne situasjon fører til forskjellige signal deformasjoner med mer enn bare en positiv og en negativ nedbøyning eller med en delt signalform, redusert amplitude, og / eller utvidet signal (fig. 3C). For å sikre den klassiske orthodrome signal utbredelse fra punktet av stimulering til muskelen, skal bare de opptakene anvendes for kvantifisering som viser en klar form som vist i figur 3B.
Det må tas hensyn til at anestesi kan påvirke elektrofysiologiske opptak på perifere nerver. Tidligere rapporter tydet på at bruken av isofluran for ennesthesia reduserer CMAP verdier markert, sammenlignet med CMAP Måling under nonanesthetized forhold 14. Ikke desto mindre, har de heri benyttes prosedyren minimal innvirkning på NCV, gir reproduserbare data i hele den eksperimentelle resultater og er den sikreste og mest effektive metode for anestesi for å vurdere perifere nervefunksjoner hos mus 15.
Til slutt må man vurdere at isjiasnerven inneholder både motoriske og sensoriske fiber traktater. En separat analyse av enten motor-eller sensoriske komponenter er umulig på grunn av det heri benyttes eksternt supra-maksimal nervestimulering og indusert orthodrome signal utbredelse. For å løse dette problemet, vi også utført elektrofysiologiske opptak fra Sural nerve 16, en ren sensorisk nerve som kan stimuleres på laterale ankel av musens hind lem. Men den lille størrelsen på Sural nerve fører til følgende problemer: For det første, typisk en ganske likan fås ll potensial størrelse under opptak som kreves avansert dataanalyse. For det andre, kan et visst antall akutte skader i Sural nerve under studien på grunn av punktering ikke unngås under forsøk på å oppnå opptak.
I motsetning til andre protokoller 17, er det ikke nødvendig å trekke ut nerve av interesse - i vårt tilfelle hoftenervene - forut for målingene. Ved å ta opptak fra en konservert organisme, blir fysiologiske tilstander i intakt nerve miljø bevart. Videre er vevsskade til musene liten i forhold til mer invasive prosedyrer.
På den annen side, gjør jevn gjengivelse av stimuler vanskeligere mangelen på nerve eksponering ved hjelp av denne teknikk, siden synlig bekreftelse av korrekt plassering av elektrodene i forhold til hoftenervene er ikke mulig. Men samtidig overvåking av responskurvene i løpet Recordings er en enkel måte å pålitelig definere riktig stimulering nål posisjonering.
Ved hjelp av denne metoden, kan ulike eksisterende og nye musemodeller av nevromuskulære sykdommer være skikkelig preget i form av nerveledningsegenskaper: demyeliniserende fenotyper klart kan skilles fra dyremodeller av primært muskuløse eller aksonale sykdommer, for eksempel som vist i en tidligere arbeid der den beskrevne Metoden har blitt utført 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av SFB 604, DFG MO 1421/2-1 og Krebshilfe 107089 (til HM). AS er mottaker av en Young Investigator Award fra Tumor Barnas Foundation (New York, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
References
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F.
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M.
- Stalberg, E., Falck, B.
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
