Barnes Estratégias Teste Labirinto com pequenas e grandes roedores Modelos

Summary

O dry-terra Barnes labirinto é amplamente utilizado para medir a capacidade de navegação espacial em resposta a estímulos aversivos levemente. Nos dias consecutivos, o desempenho (por exemplo, a latência para localizar gaiola escape) de indivíduos do grupo controle melhora, indicativo de aprendizagem normal e memória. As diferenças entre ratos e camundongos exigem aparelhos e metodologia mudanças que estão detalhadas aqui.

Abstract

Aprendizagem espacial ea memória de roedores de laboratório é frequentemente avaliada por meio de capacidade de navegação em labirintos, o mais popular dos quais são o (Barnes) labirintos de água e em terra seca. Melhor desempenho mais sessões ou julgamentos é pensado para refletir o aprendizado ea memória da localização gaiola fuga / plataforma. Considerado menos estressante do que labirintos de água, o labirinto Barnes é um projeto relativamente simples de uma plataforma superior circular com vários furos igualmente espaçados em torno da borda do perímetro. Todos com exceção de um dos buracos são falsos de fundo ou cego fim, enquanto uma leva a uma gaiola de fuga. Um suave estímulo negativo (por exemplo, lâmpada de tecto brilhantes) proporcionar motivação para localizar a gaiola fuga. A latência para localizar a gaiola de escape pode ser medido durante a sessão, no entanto, os pontos de extremidade adicionais requerem tipicamente de gravação de vídeo. A partir dessas gravações de vídeo, o uso de software de monitoramento automatizado pode gerar uma variedade de pontos de extremidade que são semelhantes aos produzidos em labirintos de água (por exemplo, </ Em> distância percorrida, velocidade / velocidade, o tempo gasto no quadrante correto, o tempo gasto em movimento / repouso, e confirmação de latência). Tipo de estratégia de busca (ou seja, aleatória, serial, ou direta) pode ser classificado como bem. Construção de labirinto e de teste podem diferir Barnes metodologias para pequenos roedores, tais como ratos, e grandes roedores, tais como ratos. Por exemplo, enquanto pistas extra-labirinto são eficazes para os ratos, roedores selvagens menores podem necessitar de estímulos intra-labirinto com uma barreira visual em torno do labirinto. Estímulos apropriados devem ser identificados que motivar o roedor para localizar a gaiola fuga. Ambos Barnes e labirintos de água pode ser demorado como 4-7 ensaios do teste são tipicamente necessários para detectar a aprendizagem e da memória (por exemplo, um desempenho melhorado latências mais curtos ou comprimentos de percurso para localizar a plataforma de escape ou da gaiola) e / ou diferenças entre os grupos experimentais. Mesmo assim, o labirinto Barnes é uma avaliação de comportamento amplamente utilizado medir habilidades de navegação espacial eseu potencial perturbação por genéticas, manipulações neurocomportamentais, ou exposição a drogas / tóxico.

Introduction

Aprendizagem espacial ea memória em roedores de laboratório foi avaliada pela primeira vez com ratos privados de alimentos, que navegou um labirinto de becos para localizar um reforço alimentar ^1. Várias décadas depois, um sistema de memória de referência espacial foi proposta ^2. Em contraste com a memória de trabalho, que se refere à memória dentro de uma sessão de teste ou julgamento, memória de referência refere-se a memória através de sessões de testes ou ensaios e está mais intimamente relacionada com a memória de longo prazo.

Vários tipos de labirintos foram desenvolvidos como avaliações não invasivas desta aprendizagem dependente do hipocampo e memória espacial em pequenas e grandes roedores (eg labirinto aquático, múltiplos T-labirinto, radial braço labirinto e labirintos dry-terra) ^3-6. Aqui, vamos nos concentrar na plataforma circular ou Barnes labirinto, descrita pela primeira vez em 1979 pelo Dr. Carol Barnes ^7. Este labirinto foi usado para testar a aprendizagem espacial e a memória de navegação em uma vasta gama de modelos de roedores, incluindo ratos (RaTTU norvegicus), camundongos (Mus musculus), veados camundongos (Peromyscus maniculatus bairdii), ratos Califórnia (Peromyscus californicus) e roedores hystricomorph (por exemplo, degus [Octodon degus]) ^8-13. Outras espécies avaliadas usando o labirinto Barnes incluem baratas americanas (Periplaneta americana) ^14, cobras do milho (Elaphe guttata guttata) ^15,   répteis Squamata (por exemplo, lagartos manchado do lado [Uta stansburiana]) ^16, e primatas não-humanos (por exemplo, os lêmures de rato [Microcebus murinus]) ^17. Nos nossos laboratórios, o desempenho do labirinto de Barnes tem sido utilizada como um índice de neurotoxicidade, após desenvolvimento bisfenol A (BPA) ou etinilestradiol (EE2) exposição ^9-1113. Também é comumente utilizado para a fenotipagem comportamento de várias linhagens de camundongos ^18-21, a avaliação dos efeitos do envelhecimento ^7,22-28, e def relacionada com a doença de Alzheimericits em modelos animais ^3,29-33, bem como os efeitos do exercício e alimentar, do ambiente, e alterações metabólicas ^34-42.

Uma vantagem principal da utilização de Barnes labirinto é que ele induz menos stress nas questões relativas ao labirintos de água, tais como o labirinto de água de Morris ^43, embora ambos possam induzir aumentos significativos na concentração plasmática de corticosterona em ratos ^44. Como um labirinto terra seca, o labirinto Barnes podem ser mais relevantes para ethologically-roedores terrestres ^45. Embora o desempenho do labirinto de água tem sido mostrado para ser mais sensível a alterações genéticas em ratos ^3,46,47, o desempenho do labirinto de Barnes é mais sensível a determinadas outras alterações ^48,49. Em modelos de roedores, onde o uso labirinto de água não é possível, o labirinto Barnes pode fornecer uma avaliação aperfeiçoá-lo de retenção de memória espacial ^31. Os estímulos aversivos levemente normalmente utilizados no labirinto Barnes (luzes brilhantes), ou seja,no entanto, não pode proporcionar suficiente motivação para o roedor para localizar a gaiola de escape ^45. Além disso, os roedores podem aprender que nenhuma punição ocorre se eles não entram na jaula de fuga. Assim, em vez de procurar ativamente para a gaiola de fuga, alguns roedores explorar ativamente o labirinto por longos períodos de cada tentativa. Como revisto por Kennard e Woodruff-Pak ^24, este aumento da exploração vai prolongar a latência para localizar a gaiola de escape, comprimento de percurso, e aumentar o número de erros. Assim, a medição de vários parâmetros, incluindo latência, taxa de erro, o tempo gasto nos quadrantes corretas e incorretas, velocidade, tempo em movimento, tempo de descanso, e estratégia de busca, pode fornecer coletivamente um melhor indicador do espaço de aprendizagem de navegação e memória a capacidade de cada sujeito ^{8 -10.} Além disso, o desempenho pode ser medido como a latência para localizar a primeira gaiola de escape (medida primária) ou a latência para entrar na gaiola de escape (medida total). Alguns têm argued que as medidas primárias de desempenho são um reflexo mais preciso da aprendizagem espacial do que as medidas totais ^50. A maioria dos estudos, incluindo os exemplos descritos aqui, utilizar a latência para entrar na gaiola de escape para determinar a taxa de erro e a estratégia de pesquisa. Além disso, alguns sistemas de software de monitoramento tem um sistema de detecção de corpo de três pontos que podem medir as freqüências de cheirar os contra buracos incorretas corretas. Finalmente, o labirinto deve ser cuidadosamente limpos com etanol entre ensaios para remover sinais olfativos que poderiam fornecer pistas ou provar uma distração para os animais subseqüentes.

Projetos de labirinto Barnes variar, mas geralmente cada um tem 12 ou 20 possíveis buracos de fuga, apenas um dos que leva à casa ou uma gaiola de fuga. A gaiola de escape pode estar situada tanto diretamente abaixo do buraco de fuga no último labirinto (por labirintos sem paredes) ou embutido na parede em torno do labirinto. As pistas podem variar em tamanho de cerca de 16,5 centímetros de altura ou de largura (no mAZE) a uma linha horizontal 21,6 centímetros de largura colocados do chão ao teto da parede do quarto do lado de fora do labirinto. Figuras 1-5 mostram exemplos de projetos de labirinto de Barnes para espécies Peromyscus (Figura 1) e ratos (Figuras 2-5). Plugs ou fundos falsos deve cobrir os buracos nonescape para evitar que o animal caia para fora do labirinto. Tamanho da sala de teste pode variar (~ 20 m ^2), mas deve ser grande o suficiente para fornecer um amplo espaço para o labirinto, habituar os animais para a sala, com capacidade de um computador com vídeo set-up (se usado), e um lugar para o experimentador de se sentar a uma distância (pelo menos ~ 122 cm) do aparelho labirinto de tal forma que a sua presença não interfere com o desempenho do animal. Cessão de fuga localização gaiola deve ser equilibrada entre os grupos de tratamento e sexo. Enquanto os procedimentos específicos descritos aqui não incluem girar o labirinto entre ensaios para desencorajar o uso do intra-labirinto odor pistas, alguns estudosincorporar esse procedimento ^50. Em nossos procedimentos, o labirinto é limpo com etanol entre ensaios para eliminar sinais de odor.

Em localizar a gaiola fuga, três tipos de estratégias de busca foram definidos (originalmente chamados "padrões" de Barnes ^7): 1) aleatórios, operacionalmente definidos como pesquisas localizadas de buracos separados por caminhos que cruzam o centro do labirinto, 2) de série, definidos como uma busca sistemática de buracos consecutivos no sentido horário ou sentido anti-horário, e 3) direta ou espacial, definida como navegar diretamente para o quadrante correto, sem atravessar o centro do labirinto mais de uma vez e com três ou menos erros. Em geral, com testes repetidos, roedores normalmente progredir através das estratégias de busca na ordem listada (aleatória, serial e direto) ^51. Um ensaio de sonda sem gaiola de escape, também pode ser usado como uma medida adicional de memória ^50.

O protocolo e representanteresultados aqui foram desenvolvidos dois tipos de roedores (pequenos roedores Peromyscus espécies, caso contrário chamados) e ratos. Enquanto esses procedimentos gerais podem também conter para camundongos endogâmica e / ou outbred (Mus musculus), outros estudos devem ser consultados sobre as diferenças de metodologia potenciais para estas últimas espécies ^18-21.

Protocol

1. Barnes Labirinto Procedimento para pequenos roedores Acenda as luzes do teto acima do labirinto e lugar "Não entre" os sinais do lado de fora da porta do laboratório. Traga ratinhos nas suas gaiolas normais para a sala de teste de aproximadamente 30 minutos antes de começar o primeiro ensaio para permitir a habituação. Se a sala é calma, pode não ser necessário incluir o ruído branco, caso contrário, esta medida de precaução pode ser considerada. Configure o progra…

Representative Results

Sexualmente maduros ratos de cervos machos são dependentes de maior capacidade de navegação espacial para localizar parceiros potenciais criadouros, que são amplamente divulgados em todo o ambiente. Tanto a exposição pré-natal e adulto de testosterona são essenciais na organização e activar esta tarde comportamento adulto masculino 53. Como tal, presume-se que a exposição precoce aos compostos de desregulação endócrina pode perturbar esse traço mais tarde nos machos. Para testar esta hipótese…

Discussion

As etapas críticas em procedimentos de testes de labirinto Barnes incluem: 1) proporcionar o bom estímulo aversivo levemente para motivar o animal para localizar a gaiola de fuga, 2) garantia de condições uniformes são mantidos através dos testes em animais (por exemplo, o tempo de teste, testes de pessoal, controle de ruído externo, e outros estímulos que podem afetar o desempenho), 3) se os ensaios são vídeos gravados, otimizando e assegurando a gravação de vídeo adequada e arquivo de volta, e 4)…

Materials

NOTE: Those items that are for small rodents only are bolded. Those items that are for large rodents only are italicized. Items neither bolded nor italicized are for both.
Barnes Maze platform with 12 or 20 escape holes every 30°. For rats, each hole is 10.5 cm in diameter and 4 cm from the maze top edge. For use with automated tracking programs, a black top for white rodents or a white top for pigmented rodents is needed. For mice and rats, this circular top is 95 and 122 cm in diameter, respectively.	US Plastics Corp, Lima, OH	42625	This is the top of the Barnes Maze and the surface that the rodent is placed upon. It can be constructed from a variety of materials (e.g. Plexiglas), but for endocrine disruptor work, polypropylene BPA-free material is optimal. One of the holes leads to the an escape cage; all other holes are blind-ending or false-bottomed. For the rat maze, small slides on the underside of the maze platform allow the escape cage and false bottoms to slide in.
2" Polypropylene pipe plug (24) 2" 90° Black polypropylene elbow (12) 2" x 6" Polypropylene pipe nipple (1)	US Plastics Corp, Lima, OH	30724 32086 30712	These are only necessary for the small rodent (e.g. mouse) Barnes Maze. These adaptations are either blind-ending tubes/elbows or one of the tubes is connected to the pipe nipple that then leads to the escape cage.
False bottoms for rat Barnes Maze			These were custom made of ABS plastic and vacuum molded for the rat maze apparatus.
Circular aluminum wall/barrier (50 cm high) around the maze	Ace Hardware, Columbia, MO		In the case of small rodents (e.g. mice), this barrier prevents them from falling off the maze; the rat apparatus generally does not require this. The wall may not be needed for laboratory mice that are relatively tame.
Support stand for maze platform top	US Plastics Corp, Lima, OH	42625	The stand supports the maze platform top such that it is elevated above the floor (typically, 70-100 cm) to motivate the rodent to locate the escape cage. The stand can be constructed of any material.
White noise	SleepMate Sound Conditioner, Marpac, Rocky Point, NC	980A	Background noise may be used to block out peripheral acoustic cues that may confound Barnes Maze testing across trials and animals
Light fixtures and 300-500 watt bulbs encased in aluminum shells. For example, Utilitech 500-watt halogen portable work lights.	Ace Hardware or Lowes		Bright lights provide a mildly aversive stimulus which motivate the rodent to locate the escape cage. The lights are generally suspended ~150 cm above the maze top.
Escape cage. For small rodents, this can be a polypropylene cage (27.8 x 7.5 x 13 cm).	Ancare, Bellmore, NY	N40 PP	The rat escape cage here was custom built and has a ramp leading into the escape cage.
Opaque tube (rats only) (27 cm diameter; 23 cm height) with a piece of thick cardboard to cover the top.			The tube is placed in the center of the maze and the rat is placed into the tube from the top which is covered with the cardboard. A handle on the outside of the tube allows easier lifting of the tube, which then begins the trial. The tube can be constructed of any material, but should be opaque.
High resolution video camera (e.g. Panasonic Digital Video Camera)	Panasonic, Secaucus, NJ	ICV19458	The video camera is positioned overhead and records trials for later analysis.
Extra- or intra-maze geometric cues made of high quality cardboard construction paper	Any office supply store, such as Staples.		These visual cues orient the animal within the maze environment, providing cues as to the spatial location of the escape cage; in rats, extra-maze cues on the walls work well, whereas in small rodents that require a wall around the maze, intra-maze cues must be used.
Black curtain to surround the maze (small rodents only)	Any fabric and crafts store, such as Jo-Ann Fabrics		A black curtain is used in small rodents (especially wild species, e.g. Peromyscus) to maintain attention within the maze confines.
70% ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	After each trial, the maze top and escape cage are cleaned to eliminate potential odor cues for consecutively tested rodents.
Tracking software program, such as Ethovision, and computer with appropriate video card and substantial (1 TB or more) hard-drive space. Alternatively, videos can be recorded directly to the computer for later analysis using a program such as Win TV (Hauppauge Computer Works, Inc.).	Noldus (Leesburg, VA)		Tracking software is required to analyze trials for latency to locate the escape cage, velocity, distance traveled, time spent resting, time spent moving, time spent in the correct versus incorrect quadrants, time spent around the escape hole, number of errors or entries into incorrect holes, and overall search strategy employed to find the escape cage.
External hard drives, such as Seagate or WD, with a minimum 1- 2 TB of memory	Any office supply store, such as Staples.		Videorecordings should be backed up in at least one separate location.
Videorecording program, e.g. WinTV program	Hauppauge Computer Works, Inc., Hauppauge, NY		If tracking software is not available at the time of the testing, the trials should be video-recorded for later analysis