وقد جرت العادة على استخدامها مناعي غير المباشرة (معهد التمويل الدولي) فحوصات للكشف عن الأجسام المضادة للنواة (ANA) في مصل الدم البشري. وجود هذه الأجسام المضادة يمكن أن تساعد في تشخيص الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية (التنمية الزراعية والريفية). يوضح هذا البروتوكول كيفية تنفيذ الفعال للتقنية معهد التمويل الدولي للكشف عن الأجسام المضادة هذه بدقة.
الكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم في بيان موقف اختبار ANA ينص على استخدام IIF كأسلوب المعيار الذهبي لفحص ANA 1. على الرغم من أن معهد التمويل الدولي هو اختبار الفحص ممتازة في أيدي الخبراء، والصعوبات التقنية لمعالجة وقراءة الشرائح معهد التمويل الدولي – مثل تجهيز العمل المكثف الشرائح، قراءة دليل، والحاجة إلى ذوي الخبرة والتقنيين المدربين واستخدام غرفة مظلمة – جعل الأسلوب معهد التمويل الدولي من الصعب احتواؤها في سير العمل، والمختبرات الآلي الحديثة.
الخطوة الأولى والحاسمة تجاه جودة عالية ANA الفحص هو تجهيز الشريحة حذرا. هذا الإجراء هو العمل المكثف، ويتطلب الفهم الكامل لهذه العملية، وكذلك الانتباه إلى التفاصيل والخبرة.
يتم تنفيذ القراءة الشريحة بواسطة المجهر الفلورسنت في غرف مظلمة، ويتم ذلك عن طريق التقنيين المدربين الذين معتادا على أنماط مختلفة، في سياق دورة الخليةومورفولوجية البيني وتقسيم الخلايا. شريطة أن معهد التمويل الدولي هو أول أداة فحص خط التنمية الزراعية والريفية، وفهم الخطوات لتنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية.
مؤخرا، تم تطوير أنظمة التصوير الرقمي للقراءة الآلية من الشرائح معهد التمويل الدولي. هذه الأنظمة، مثل NOVA مشاهدة الآلي نيون مجهر، وقد صممت لتبسيط سير العمل الروتينية معهد التمويل الدولي. عرض NOVA يكتسب ومخازن عالية الدقة الصور الرقمية من الآبار، وبالتالي فصل الحصول على الصور من التفسير؛ وينظر إلى الصور وتفسيرها على شاشات الكمبيوتر عالية الدقة. فإنه يخزن الصور كمرجع في المستقبل، وتدعم تفسير المشغل من خلال توفير البيانات الفلورسنت شدة الضوء على الصور. كما أنه يصنف مبدئيا النتائج بأنها إيجابية أو سلبية، ويوفر نمط الاعتراف للعينات الإيجابية. وباختصار، فإنه يلغي الحاجة إلى غرفة مظلمة، وبأتمتة ويبسط readi معهد التمويل الدولينانوغرام / تفسير سير العمل. الأهم من ذلك، لأنه يزيد من الاتساق بين القراء والقراءات. علاوة على ذلك، مع استخدام الشرائح barcoded، يتم استبعاد أخطاء النسخ من خلال توفير إمكانية التتبع وتحديد عينة إيجابية المريض. هذا يؤدي إلى زيادة تكامل البيانات وسلامة المريض.
الهدف العام من هذا الفيديو هو للتدليل على الإجراء معهد التمويل الدولي، بما في ذلك تجهيز الشريحة، والتعرف على أنماط معهد التمويل الدولي المشترك، وإدخال التطورات الجديدة إلى تبسيط ومواءمة هذه التقنية.
الأجسام المضادة للنواة المدى (ANA) يصف مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة التي تتفاعل مع مكونات نواة الخلية بما في ذلك الحمض النووي والبروتينات وribonucleoproteins 1، 2. الخلية التهاب الكبد-2، مجموعة البروتين الأصلي مع مئات من المستضدات، يوفر ركيزة مثالية للكشف عن ANA 1. الكشف عن ANA في مصل الدم البشري هو أداة مهمة لفحص أمراض النسيج الضام، ومعهد التمويل الدولي هو الأسلوب مرجعية لANA اختبار 1. مؤخرا، تم استبدال معهد التمويل الدولي على التهاب الكبد-2 في الخلايا المناعية بعض المختبرات مع مستضد محددة وأساليب متعددة. بسبب المخاوف من نتائج سلبية كاذبة وانعدام الشفافية للأطباء، والكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم شكلت فرقة العمل التي خلصت إلى أن معهد التمويل الدولي باستخدام خلايا التهاب الكبد-2 يجب أن يكون "المعيار الذهبي" لفحص ANA 1.
نظرا لطبيعة الشخصية للANA الفحص ونوعية التهاب الكبد-2 الخلايا فيtegral إلى تقارير دقيقة واثقة من النتائج. وجود عدد كبير من الخلايا الإنقسامية، مورفولوجيا الخلايا الأمثل، confluency كافية، والتعبير عن مستضدات ذات الصلة أهمية خاصة. يقدم معهد التمويل الدولي والتعرف على نمط كأداة مهمة للمساعدة في تشخيص المريض. فهم أهمية أنماط مختلفة تمكن الأطباء والعاملين في المختبرات المناسبة لأداء اختبار المتابعة لتأكيد التشخيص. على سبيل المثال، يمكن أن يحدث متجانسة نمط ANA بحضور مكافحة dsDNA والأجسام المضادة أو لونين، وربما تترافق مع الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) 3. من الجانب الآخر، وصفت مؤخرا أن يسمى كثيفة نمط الأرقط غرامة (DFS) التي ينظر اليها عادة في ما يصل إلى 12٪ من عينات روتينية، ومعظمها ارتبطت الأجسام المضادة للDFS70. هذه الأجسام المضادة، عندما وجدت في عزلة (دون أخرى ANA بأمراض محددة) لا يرتبط مع الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية <سوب> 4-9. الاختبار التأكيدي بذلك عن الأجسام المضادة لمكافحة DFS70 يمكن أن تساعد في الحد من غير الضروري اختبار رد الفعل، وتقديم وفورات كبيرة في التكاليف، وتخفيف القلق المريض.
بالنظر إلى أن معهد التمويل الدولي هو أول منهجية الفحص للكشف عن الأجسام المضادة الخط، فإنه من الأهمية بمكان أن يفهم كيف للمستخدم اختيار الكواشف وركائز الأنسجة يمكن أن تؤثر على النتائج. منذ تقنية معهد التمويل الدولي هو ذاتي بطبيعتها، فمن المهم أن الكواشف المستخدمة توفير أعلى نوعية النتائج.
هذا الهدف من هذا البروتوكول الفيديو هو تعريف المستخدم مع الخطوات الصحيحة اللازمة لأداء الأسلوب معهد التمويل الدولي، والأنماط الشائعة المرتبطة ANA، وإدخال التطورات الجديدة التي يمكن تبسيط سير العمل وتوحيد النتائج المختبرية.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
نشكر كاساندرا براينت لأداء التجربة معهد التمويل الدولي وكارول بوخنر لها الاستعراض التقني الخبير.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |