Karakterisering af komplekse systemer ved hjælp af udformning af eksperimenter Fremgangsmåde: Transient Protein Expression i tobak som et casestudie

Summary

Vi beskriver en udformning af eksperimenter tilgang, der kan anvendes til at bestemme og modellere indflydelse transgene regulatoriske elementer, parametre planters vækst og udvikling og inkuberingsbetingelser på forbigående ekspression af monoklonale antistoffer og reporter-proteiner i planter.

Abstract

Planter giver flere fordele for produktionen af ​​biofarmaceutiske herunder lave omkostninger, skalerbarhed og sikkerhed. Forbigående udtryk giver den yderligere fordel af korte udviklings-og produktionstider, men udtryk niveauer kan variere betydeligt mellem partier og dermed give anledning til samme reguleringsmæssige problemer i forbindelse med god fremstillingspraksis. Vi brugte et design af eksperimenter (DOE) tilgang til at fastslå virkningen af ​​væsentlige faktorer, såsom regulatoriske elementer i ekspressionskonstruktet, plantevækst og udvikling parametre og inkubationsbetingelserne under udtryk, om variabilitet i udtryk mellem partier. Vi testede planter, der udtrykker en model anti-HIV monoklonale antistof (2G12) og en fluorescerende markør protein (DsRed). Vi diskuterer begrundelsen for at vælge bestemte egenskaber af model og identificere dens potentielle begrænsninger. Den generelle indstilling kan nemt overføres til andre problemer, fordi principperne i modellen enre bredt anvendelig: videnbaseret parameter udvælgelse, kompleksitet reduktion ved at opdele det oprindelige problem i mindre moduler, software-guidet opsætning af optimale eksperimentkombinationer og trinvis design augmentation. Derfor er den metode er ikke kun nyttig til at karakterisere protein ekspression i planter, men også til undersøgelse af andre komplekse systemer, der mangler en mekanistisk beskrivelse. De prædiktive ligninger, der beskriver sammenkoblingen mellem parametre kan bruges til at etablere mekanistiske modeller for andre komplekse systemer.

Introduction

Produktionen af biofarmaceutiske proteiner i planter er fordelagtig, fordi planter er billig at vokse, kan platformen blive skaleret op blot ved at dyrke flere planter og humane patogener er i stand til at replikere ^1,2. Transiente ekspressionssystemer strategier baseret for eksempel på infiltration af blade med Agrobacterium tumefaciens giver yderligere fordele, fordi tiden mellem det punkt af DNA levering og levering af et renset produkt nedsættes fra år til mindre end 2 måneder ^3. Transient ekspression er også anvendes til funktionel analyse, fx at teste gener for deres evne til at komplementere tab af funktion mutanter eller for at undersøge protein-interaktioner ^4-6. Men forbigående udtryk niveauer tendens til at vise større batch-til-batch variation end ekspressionsniveauer i transgene planter ^7-9. Dette reducerer sandsynligheden for, at biofarmaceutiske fremstillingsprocesser baseret på forbigående ekspression will blive godkendt i forbindelse med god fremstillingspraksis (GMP), fordi reproducerbarhed er en attribut kritisk kvalitet og er underlagt risikovurdering ^10. Sådanne variationer kan også maskere enhver interaktion, forskerne har til hensigt at undersøge. Derfor er vi i gang med at identificere de væsentligste faktorer, der påvirker forbigående ekspressionsniveauer i planter og til at opbygge en høj kvalitet kvantitativ prædiktiv model.

Den ene-faktor-på-en-tid (OFAT) metode bruges ofte til at karakterisere effekten (virkning) for visse parametre (faktorer) om resultatet (respons) af et eksperiment ^11. Men det er ikke optimalt, fordi de enkelte tests (kører) under en kontrolundersøgelse (eksperiment) vil blive rettet ind som perler på en snor gennem det potentielle areal udspændt af de faktorer, der er testet (design plads). Dækningen af ​​designet rum og dermed graden af ​​information udledt fra eksperimentetlav, som det er vist i figur 1A ^12. Desuden kan den indbyrdes afhængighed mellem de forskellige faktorer (faktor interaktioner) forbliver skjult resulterer i dårlige modeller og / eller forudsigelse af falsk optima, som vist i figur 1B ^13.

De ovenfor beskrevne ulemper kan undgås ved hjælp af et design af eksperimenter (DOE) tilgang, hvor kørsler af et eksperiment er spredt mere jævnt over hele design plads, hvilket betyder, at mere end én faktor er varieret mellem to kørsler ^14. Der er specialiserede designs for blandinger, screening faktorer (Faktorforsøg) og kvantificering af faktor virkninger på reaktioner (respons overflade metoder RSM s) ^15. Desuden kan RSMs realiseres som centrale-komposit design, men kan også opnås effektivt ved hjælp af specialiseret software, som kan anvende forskellige kriterier for udvælgelse af kørsler. For eksempel, den såkaldte D-optimality kriterium vælger løber så at minimere fejlen i koefficienterne af den resulterende model, mens IV-optimalitet kriterium vælger kørsler, der opnår den laveste forudsigelse varians i hele design plads ^15,16. RSM vi beskriver her tillader præcis kvantificering af forbigående protein ekspression i planter, men det kan nemt overføres til en hvilken som helst system, der involverer flere (~ 5-8) numeriske faktorer (fx. temperatur, tid, koncentration), og et par (~ 2 – 4) kategorisk faktorer (fx promotor, farve), i hvilken en mekanistisk beskrivelse er utilgængelig eller for komplekse til at modellere.

DOE tilgang opstod i jordbrugsvidenskab, men har spredt sig til andre områder, fordi det kan overføres til en hvilken som helst situation, hvor det er nyttigt at reducere antallet af kørsler er nødvendige for at opnå pålidelige data og generere beskrivende modeller for komplekse processer. Dette har igen ført til inddragelse af DoE i "Vejledning forIndustri, Q8 (R2) Farmaceutisk udvikling "udgivet af Den Internationale Konference om Harmonisering af tekniske krav til registrering af lægemidler til mennesker (ICH) ^17. DoE er nu anvendes bredt i videnskabelig forskning og industri ^{18 år.} Dog skal man være omhyggelig under planlægning og udførelse af forsøget, fordi du vælger en forkert polynomium for flere lineær regressionsmodel (basismodel) kan introducere et behov for yderligere kørsler til at modellere alle faktor virkninger korrekt. Desuden beskadiget eller manglende data genererer forkerte modeller og fejlbehæftet forudsigelser, og kan endda forhindre enhver modelbygning forsøg som beskrevet i protokollen og diskussion § ^18. i protokollen afsnit vil vi oprindeligt fastsat de vigtigste planlægning skridt til et RSM-baserede eksperiment og derefter forklare design baseret på DoE software DesignExpert v8.1. Men lignende design kan bygges med anden software including JMP, MODDE og STATISTISK. De eksperimentelle procedurer følges af instruktioner til dataanalyse og evaluering.

Figur 1. Sammenligning af OFAT og DoE. A. Sekventiel variation af én faktor ad gangen (OFAT) i et eksperiment (sort, rød og blå cirkler) opnår en lav dækning af designet rum (skraverede områder). I modsætning hertil variation af mere end én faktor ad gangen ved hjælp af udformning af eksperimenter (DOE) strategi (grønne cirkler) forbedrer dækning og dermed præcisionen af de resulterende modeller. B. Den forudindtaget design plads dækning betyder, at OFAT eksperimenter (sorte cirkler) kan også undlade at identificere optimale drifts-regioner (rød) og forudsige sub-optimale løsninger (stor sort cirkel), mens DoE strategyes (sorte stjerner) er mere tilbøjelige til at identificere foretrukne forhold (store sorte stjerne).

Protocol

1.. Planlægning af en DoE strategi Identificere relevante faktorer og reaktioner til optagelse i designet. Definer et eller flere svar for måling. Her blev 2G12 og dsRed ekspressionsniveauer bruges (mg / ml), herunder den laveste påviselige forskel betragtes som relevante (10 og 20 mg / ml), og en tilnærmet værdi for den anslåede standardafvigelse af systemet (4 og 8 mg / ml) baseret på tidligere forsøg. Brug den tilgængelige litteratur, data fra tidligere eksperimenter eller speci…

Representative Results

En beskrivende model for DsRed akkumulering ved transient ekspression ved hjælp af forskellige initiativtagere og 5'UTRs DsRed fluorescens i bladekstrakter blev anvendt til at indikere ekspressionsniveauet af det rekombinante protein og således blev anvendt som respons i DoE strategi. Den mindste påviselige forskel, vi anset for relevante var 20 pg / ml og den anslåede standardafvigelse af systemet var 8 mg / ml baseret på indledende forsøg. Faktorer, der indgår i…

Discussion

Hvert eksperiment kræver omhyggelig planlægning, fordi ressourcerne er ofte knappe og dyre. Dette gælder især for ministeriets strategier, fordi fejl i planlægningsfasen (fx vælge en base model, der ikke dækker alle væsentlige faktor interaktioner) væsentligt kan formindske den prædiktive effekt af de resulterende modeller, og dermed devaluere hele eksperimentet. Dog kan disse fejl let undgås ved at følge grundlæggende procedurer.

Overvejelser i løbet DoE planlægning </p…

Materials

Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody