Den ChroP tilgang kombinerer Chip og massespektrometri at dissekere locusspecifik proteomiske Landskaber i Kromatin

Summary

Ved at kombinere indfødte og tværbindende kromatin immunofældning med høj opløsning massespektrometri, ChroP tilgang gør det muligt at dissekere den sammensatte proteom arkitektur histon modifikationer, varianter og ikke-histonic proteiner synergizing på funktionelt distinkte kromatin domæner.

Abstract

Kromatin er en meget dynamisk nukleoprotein kompleks lavet af DNA og proteiner, der styrer forskellige DNA-afhængige processer. Kromatin struktur og funktion på bestemte områder er reguleret af den lokale berigelse af histon post-translationelle modifikationer (hPTMs) og varianter, kromatin-bindende proteiner, herunder transkriptionsfaktorer og DNA methylering. Den proteomisk karakterisering af kromatin komposition ved distinkte funktionelle regioner har været hidtil hæmmet af manglen på effektive protokoller til at berige sådanne domæner på et passende renhed og beløb for den efterfølgende dybtgående analyse af massespektrometri (MS). Vi beskriver her en nydesignet kromatin proteomics strategi, opkaldt ChroP (CHRO matin P roteomics), hvorved en præparativ kromatin immunoprecipitation bruges til at isolere forskellige kromatin regioner, hvis funktioner i form af hPTMs, varianter og co-associerede ikke-histonic proteiner, er analyseres ved MS. Vi illustrerer hanre oprettelsen af ​​ChroP til berigelse og analyse af transkriptionelt tavse heterochromatic regioner præget af tilstedeværelsen af ​​tri-methylering af lysin 9 på histon H3. De opnåede resultater viser potentialet af ChroP i grundigt kendetegner heterochromatin proteom og bevise det som en stærk analytisk strategi for at forstå hvordan de forskellige protein determinanter for kromatin interagere og synergieffekt at etablere locusspecifikke strukturelle og funktionelle konfigurationer.

Introduction

Kromatin er en meget dynamisk nukleoprotein kompleks, der er involveret som primær skabelon for alle DNA-medierede processer. Den nukleosom er den grundlæggende gentagne enhed af kromatin og består af en proteinholdig octamer kerne indeholdende to molekyler af hver kanoniske histon H2A, H2B, H3 og H4, omkring hvilken 147 bp DNA er pakket ^1,2. Alle centrale histoner er struktureret som en kugleformet domæne og et fleksibelt N-terminal "hale", der stikker udenfor nukleosom. En af de vigtigste mekanismer til regulering chromatin struktur og dynamik er baseret på covalente post-translationelle modifikationer (PTMS), som hovedsagelig forekommer på N-terminalerne af histoner ^3,4. Histon modifikationer kan fungere enten ved ændring af højere orden chromatin struktur, ved at ændre kontakten mellem histoner-DNA eller mellem nucleosomer og dermed kontrollere tilgængeligheden af DNA-bindende proteiner (cis mekanismer), eller ved at fungere som docking sites for regulatoriske proteiner, enten som enkelte enheder, eller indlejret i multimeric komplekser. Sådanne regulerende proteiner kan udøve deres funktion på forskellige måder: ved direkte at modulere genekspression (dvs. TAF-proteiner), eller ved at ændre nukleosom positionering (dvs. chromatin remodeling komplekser) eller ved at ændre andre histon rester (dvs. proteiner med methyl-transferase eller acetyl- transferase aktivitet) (trans mekanismer) ^5.. Den observation, at særskilte PTM mønstre klynge på specifikke kromatin loci førte til udarbejdelsen af ​​den hypotese, at forskellige modifikationer på separate steder kan synergize at generere en molekylær kode medierende den funktionelle tilstand af den underliggende DNA. Den "histon kode hypotese" har vundet bred enighed i de kommende år, men dens eksperimentel verifikation har været holdt tilbage af tekniske ^6,7 begrænsninger.

Massespektrometri (MS)-baserede proteomics er opstået som enkraftfuldt værktøj til at kortlægge histon modifikation mønstre og til at karakterisere kromatin proteiner ^8. MS detekterer en ændring som et specifikt Δmass mellem den eksperimentelle og den teoretiske masse af et peptid. På de enkelte histoner, MS leverer en upartisk og omfattende metode til at kortlægge PTMS, så påvisning af nye ændringer og afslørende samspil blandt dem ^9-14.

I de seneste år er der blevet udviklet en række strategier til at dissekere proteomik sammensætning chromatin herunder karakterisering af intakte mitotiske kromosomer ^15, identifikation af opløselige hPTM proteiner ^16-18 og isolering og analyse af specifikke kromatin regioner (dvs. telomerer) ^19,20. Men den undersøgelse af locusspecifikke synergier mellem histon PTMS, varianter og kromatin-associerede proteiner er stadig ufuldstændig. Her beskriver vi en ny tilgang, opkaldt ChroP (Kro matin P roteomics) ^21, som vi har udviklet til effektivt at karakterisere funktionelt distinkte kromatin domæner. Denne fremgangsmåde tilpasser chromatin immunoprecipitation (ChIP), en veletableret protokol, der bruges i epigenetisk forskning, for en effektiv MS-baserede proteom analyse af den berigede prøve. Vi har udviklet to forskellige protokoller, afhængigt af typen af ​​kromatin anvendt som input og behandles af MS spørgsmål; især: 1) chip optagne indfødte kromatin fordøjet med MNase er ansat til at rense mono-nukleosomer og at dissekere de co-associere hPTMs (N-ChroP); 2) chip af tværbundet chromatin fragmenteres ved lydbehandling anvendes i kombination med en SILAC baseret interactomics strategi til at karakterisere alle co-berigende chromatin proteiner (X-ChroP). Vi illustrerer her kombinationen af ​​N-og X-ChroP for at berige og studere heterochromatin hjælp H3K9me3 som lokkemad for immunopræcipitationsringenes trin. Anvendelsen af ​​ChroP kan udvidesat studere enten adskilte regioner på kromatin, eller ændringer i kromatin sammensætning inden for samme region under overgangen til en anden funktionel stat og dermed bane vejen for forskellige applikationer i epigenetik.

Protocol

1. Celledyrkning Standard medium for indfødte chip Grow HeLa-celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin, 1% Pen / Strep og 10 mM HEPES pH 7,5. SILAC mærkning tværbinding chip Grow HeLa-celler i SILAC DMEM-medium, depleteret for lysin og arginin, suppleret med 10% dialyseret FBS, 1% glutamin, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5, og enten den lette L-lysin (Lys 0) og L- ar…

Representative Results

Kromatin immunofældning er en kraftfuld teknik bruges til at profilere lokaliseringen af ​​et protein eller et histon modifikation langs genomet. I et proteomics ækvivalent, er chipsættet fulgt af MS-baserede proteomics at identificere kvalitativt og kvantitativt hPTMs, histon varianter og kromatin-bindende proteiner, som er immunpræcipiterede sammen med den modifikation eller protein af interesse, der anvendes som "lokkemad". I N-ChroP fremgangsmåde skitseret i figur 1A, native chip,…

Discussion

Vi har for nylig beskrevet ChroP en kvantitativ strategi for stor skala karakterisering af proteinkomponenter kromatin. ChroP kombinerer to komplementære tilgange, der anvendes i den epigenetiske område, Chip og MS, profiterer af deres styrker og overvinde deres respektive begrænsninger. Chip koblet til dyb sekventering (chip-Seq) gør det muligt genom-dækkende kortlægning af histon modifikationer på løsningen af nogle nucleosomes ^35. Selvom fordelagtig for deres følsomhed er antistof-baserede assays …

Materials

DMEM	Lonza	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
Dialyzed FBS	Invitrogen	26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	L8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	A6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)	Sigma Aldrich	68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nuclease	Roche	10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length	Spectrumlabs	132720
QIAquick PCR purification kit	QIAGEN	28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade	Abcam	ab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9	Abcam	ab1773
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0335BOX
Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Aceti anhydride-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline	Sigma Aldrich	I6125
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg)	Promega	V5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5	Microcolumn Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15 % C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
C18 extraction disk, 47 mm	Agilent Technologies	1​2​1​4​5​0​0​4
Carbon extraction disk, 47 mm	Agilent Technologies	12145040
Cation extraction disk	Agilent Technologies	66889-U