A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina
Summary
Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.
Abstract
Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico feitos de DNA e proteínas que controla vários processos dependentes de DNA. A estrutura da cromatina e a função em regiões específicas é regulada pelo local de enriquecimento de histonas modificações pós-tradução (hPTMs) e variantes, proteínas de ligação da cromatina, incluindo factores de transcrição, e a metilação do DNA. A caracterização proteômica da composição da cromatina em regiões funcionais distintas até agora tem sido dificultada pela falta de protocolos eficientes para enriquecer tais domínios na pureza e quantidade adequada para a posterior análise em profundidade por Espectrometria de Massa (MS). Descrevemos aqui uma estratégia proteômica cromatina recém-concebido, chamado ChroP (Chro roteomics matin P), em que a cromatina imunoprecipitação preparativa é usado para isolar regiões de cromatina distintas cujas características, em termos de hPTMs, variantes e co-associados proteínas não histonic, são analisado através de EM. Nós ilustramos elere a criação de ChroP para o enriquecimento e análise das regiões heterocromáticas transcricionalmente silenciosos, marcado pela presença de tri-metilação da lisina 9 na histona H3. Os resultados obtidos demonstram que o potencial de ChroP no completamente caracterizar o proteoma heterocromatina e provar como uma estratégia de análise poderoso para a compreensão de como os determinantes de proteínas distintas da cromatina interagir e sinergizam para estabelecer configurações estruturais e funcionais específicas para um local.
Introduction
Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico, que está envolvido como modelo principal para todos os processos mediados por ADN. O nucleossoma é a unidade básica repetida de cromatina e consiste de um núcleo octamérico proteico contendo duas moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 e H4, em torno dos quais 147 pb de ADN são enrolados 1,2. Todas as histonas centrais são estruturados como um domínio globular e uma "cauda" N-terminal flexível que se projeta fora do nucleossomo. Um dos principais mecanismos de regulação da estrutura da cromatina e dinâmica é baseado no covalentes modificações pós-traducionais (PTMs), que ocorrem principalmente no terminal N das histonas 3,4. Modificações de histonas pode funcionar tanto alterando a estrutura de ordem mais elevada da cromatina, alterando os contactos entre as histonas-ADN ou entre nucleossomas, e, assim, controlar a acessibilidade de proteínas de ligação de ADN (mecanismos cis), ou actuando como dockinsites de g para proteínas reguladoras, seja como unidades individuais ou incorporados em complexos multiméricas. Tais proteínas reguladoras podem exercer a sua função de diferentes maneiras: por modulando directamente a expressão do gene (ou seja, proteínas TAF), ou através da alteração do posicionamento nucleossoma (isto é, a remodelação da cromatina complexos) ou por modificação de outros resíduos de histonas (isto é, proteínas com metil-transferase, ou acetil- atividade transferase) (mecanismos de trans) 5. A observação de que o aglomerado distinto padrões PTM cromatina em loci específicos conduziu à elaboração da hipótese de que diferentes modificações em locais distintos podem sinergizar a gerar um código molecular mediando o estado funcional do DNA subjacente. A "hipótese código de histonas" ganhou amplo consenso nos próximos anos, mas a sua verificação experimental foi retido por limitações técnicas 6,7.
Proteoma com base em espectrometria de massa (MS) tem emergido como umpoderosa ferramenta para mapear padrões de modificação de histonas e caracterizar proteínas de ligação da cromatina 8. MS detecta uma alteração como uma Δmass específica entre a massa experimental e teórica de um péptido. Ao nível das histonas individuais, MS fornece um método imparcial e abrangente para mapear PTMs, permitindo a detecção de novas modificações e interplays reveladoras entre eles 9-14.
Nos últimos anos, um número de estratégias têm sido desenvolvidas para dissecar a composição proteoma da cromatina, incluindo a caracterização de cromossomas mitóticos intactos 15, a identificação de proteínas de ligação solúveis hPTM 16-18 e o isolamento e a análise das regiões de cromatina específicos (isto é, telômeros) 19,20. No entanto, a investigação das sinergias específicas para um local entre PTMs de histonas, variantes e proteínas associadas à cromatina ainda está incompleta. Aqui, descrevemos uma nova abordagem, denominada ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que temos desenvolvido para caracterizar de forma eficiente domínios de cromatina funcionalmente distintas. Esta abordagem adapta imunoprecipitação da cromatina (ChIP), um protocolo bem estabelecida utilizada na investigação epigenética, para a análise do proteoma com base no MS eficiente da amostra enriquecida. Nós desenvolvemos dois protocolos diferentes, dependendo do tipo de cromatina usado como entrada e a pergunta dirigida por MS; em particular: 1) CHIP da cromatina nativa unfixed digerido com MNase é empregado para purificar mono-nucleossomos e dissecar os hPTMs co-associando (N-ChroP); 2) ChIP de cromatina reticulado fragmentadas por sonicação é usado em combinação com uma estratégia baseada no interactomics SILAC caracterizar todos cromatina co-enriquecendo proteínas (X-ChroP) de ligação. Nós ilustramos aqui a combinação de N-e X-ChroP para enriquecer e estudando heterochromatin, usando H3K9me3 como isca para as etapas de imunoprecipitação. O uso de ChroP pode ser estendidoestudar tanto regiões distintas sobre cromatina, ou alterações na composição da cromatina dentro da mesma região durante a transição para um estado funcional diferente, abrindo assim o caminho para diversas aplicações em epigenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos recentemente ChroP, uma estratégia para a caracterização quantitativa em grande escala de componentes proteicos de cromatina. ChroP combina duas abordagens complementares utilizados no campo epigenética, chip e MS, lucrar com os seus pontos fortes e superar suas respectivas limitações. CHIP acoplado ao seqüenciamento de profundidade (CHIP-Seq) permite o mapeamento do genoma de modificações de histonas na resolução de alguns nucleossomos 35. Embora vantajosa para a sua sensibilidade, os …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi publicada originalmente em Mol Proteômica celulares. Soldi M. e Bonaldi T. A proteômica Investigação de cromatina domínios funcionais revelou novas sinergias entre Distinct Heterochromatin Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Agradecemos Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnologia e IEO, Itália) para a leitura crítica do manuscrito. Trabalho TB é apoiada por doações da Fundação Harvard Armenise-Programa de Desenvolvimento de Carreira Giovanni, a Associação Italiana para a Pesquisa do Câncer e do Ministério da Saúde italiano. Trabalho MS foi apoiado por uma bolsa FIRC.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
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