Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

Summary

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l'utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

Abstract

La maggioranza dei decessi per cancro si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica. Questa fase malattia altamente letale è associata con la presenza di cellule tumorali circolanti (CTC). Queste cellule rare hanno dimostrato di essere clinicamente significativa in seno metastatico, della prostata e del colon-retto. Il gold standard attuale in clinica rilevazione CTC ed enumerazione è il sistema CellSearch approvato dalla FDA (CSS). Questo manoscritto descrive il protocollo standard utilizzato da questa piattaforma nonché due protocolli adattati aggiuntive che descrivono il processo dettagliato di ottimizzazione marcatore definito dall'utente per la caratterizzazione di proteine ​​CTC paziente e un protocollo paragonabile per la cattura CTC molto bassi volumi di sangue, utilizzando lo standard reagenti CSS, per lo studio in vivo modelli preclinici murini di metastasi. Inoltre, differenze di qualità tra CTC sangue donatore sano addizionati con cellule di coltura tissutale rispetto paziente samp sangueles sono evidenziati. Infine, diversi oggetti comunemente discrepanti che possono portare ad errori di classificazione CTC sono delineati. Presi insieme, questi protocolli forniranno una risorsa utile per gli utenti di questa piattaforma interessati alla ricerca preclinica e clinica di pertinenza di metastasi e CTC.

Introduction

Nel 2013 si stima che 580.350 persone muoiono di cancro e che i 1.660.290 nuovi casi di questa malattia viene diagnosticata in solo ¹ negli Stati Uniti. La maggior parte di questi decessi si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica ^2. L'attuale mancanza di terapie efficaci nel trattamento di metastasi e di una comprensione limitata della cascata metastatica rende questo stadio della malattia altamente letale. La presenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue sono stati dimostrati correlati con malattia metastatica ^3. Queste cellule sono estremamente rari e la loro individuazione è indicativa di sopravvivenza globale in seno metastatico ^{4, 5} prostata e del colon-retto ⁶ cancro. In questi pazienti, la presenza di ≥ 5 (seno e prostata) o ≥ 3 (colon-retto) CTC in 7,5 ml di sangue è indice di prognosi peggiore rispetto ai pazienti con meno o nessun CTC rilevabili nelle samil volume e il sangue. Inoltre, la variazione del numero CTC durante o dopo l'intervento terapeutico è stato dimostrato per essere utile come predittore di risposta al trattamento, spesso prima di tecniche attualmente utilizzate ^7-10.

È stato stimato che, in pazienti tumorali metastatiche, CTC verificano ad una frequenza di circa 1 a 10 CTC ⁵ -10 ⁷ cellule mononucleate del sangue e in pazienti con malattia localizzata, questa frequenza può essere anche inferiore (~ 1 in 10 ^8). La natura rara di queste cellule può rendere difficile accurato e affidabile rilevare e analizzare CTC ^11. Diversi metodi (recensito in precedenza ^12-14) sono state utilizzate per arricchire e rilevare queste cellule sfruttando le proprietà che li differenziano dai circostante componenti del sangue. In generale, CTC enumerazione è un processo a due fasi che richiede sia una fase di arricchimento e una fase di rivelazione. Tradizionalmente, passaggi di arricchimento si basano su differenze di educazione fisicaProprietà iCal di CTC (dimensioni delle cellule, la densità, deformabilità) o sull'espressione proteina marker (cioè di adesione delle cellule epiteliali molecola [EpCAM], citocheratina [CK]). Seguendo arricchimento, rilevazione CTC può essere eseguita in vari modi diversi, il più comune dei quali sono saggi a base di acido nucleico e / o approcci citometria. Ognuna di queste strategie sono uniche, avendo vantaggi e svantaggi, ma tutti mancano normalizzazione; una necessità per l'ingresso in ambito clinico. Il sistema CellSearch (CSS) è stato quindi sviluppato per fornire un metodo standardizzato per il rilevamento e l'enumerazione di rari CTC nel sangue umano usando la microscopia a fluorescenza e le tecniche di base di anticorpi ^4-6. Questa piattaforma è attualmente considerato il gold standard nella CTC enumerazione ed è l'unica tecnica approvato dalla US Food and Drug Administration (FDA) per l'uso in clinica ^15.

Il CSS è una piattaforma a due COMPOSTE componentig, (1) il sistema CellTracks AutoPrep (di seguito denominato come strumento di preparazione), che automatizza la preparazione dei campioni di sangue umano, e (2) la CellTracks Analyzer II (di seguito indicato come strumento di analisi), che analizza questi campioni dopo la preparazione. Per distinguere CTC di contaminare leucociti strumento di preparazione impiega un anticorpo mediata, approccio separazione magnetica a base di ferrofluido-differenziale e la colorazione in fluorescenza. Inizialmente, il sistema etichette CTC utilizzando anticorpi anti-EpCAM coniugati a nanoparticelle di ferro. Il campione viene quindi incubato in un campo magnetico, e tutte le cellule non marcate vengono aspirati. Cellule tumorali selezionate vengono risospese e incubate in una macchia fluorescenza differenziale, costituito anticorpi di fluorescenza marcata e un reagente colorazione nucleare. Infine, il campione viene trasferito in una cartuccia magnetica, chiamato MagNest (di seguito denominato il dispositivo magnetico), e scanned usando lo strumento di analisi.

Lo strumento di analisi è utilizzato per la scansione di campioni preparati usando diversi filtri di fluorescenza, ciascuno ottimizzato alla particella fluorescente appropriato, utilizzando una lente obiettivo 10X. CTC sono identificati come cellule che sono vincolati da anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), e la macchia nucleare 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Al contrario, leucociti contaminanti vengono identificati come cellule che sono vincolati da anti-CD45-allophycocyanin (APC) e DAPI. Seguendo la scansione, potenziali cellule tumorali informatici definiti vengono presentati all'utente. Da queste immagini, l'utente deve impiegare analisi qualitativa utilizzando i parametri definiti e colorazione differenziale discussi sopra per determinare quali eventi sono CTC.

Oltre a fornire un metodo standardizzato per CTC enumerazione, il CSS permette per la caratterizzazione molecolare delle CTC sulla base di marcatori proteici di interesse. Questo interrogatorio cun essere effettuata a livello di singola cellula, utilizzando un isotiocianato di fluoresceina (FITC) canale di fluorescenza non richiesto per l'identificazione CTC ^16. Sebbene questa piattaforma fornisce la capacità di caratterizzazione molecolare, il processo dettagliato di protocollo di sviluppo e ottimizzazione non è ben definito. Tre marcatori disponibili in commercio sono stati sviluppati dal costruttore per l'utilizzo con il CSS, compreso il fattore di crescita epidermico (EGFR), fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2), e insulin-like growth factor 1 recettore (IGF-1R). Analisi HER2, in combinazione con il CSS, è stato utilizzato da diversi gruppi per illustrare il potenziale per la caratterizzazione CTC informare decisionale clinico e cambiare potenzialmente linee guida di trattamento esistenti. Ad esempio, Fehm et al. ¹⁷ dimostrato che circa un terzo dei pazienti con carcinoma mammario con tumori HER2-primario aveva HER2 ⁺ CTC. Inoltre, Liu et al.18 recentemente riportato che fino al 50% dei pazienti con HER ⁺ carcinoma mammario metastatico non ha avuto HER2 ⁺ CTC. Herceptin, un recettore HER2 interferire anticorpo monoclonale dimostrato di trarre enormi benefici pazienti i cui tumori esprimono sufficienti livelli di HER2, è un trattamento comunemente utilizzati per i pazienti con HER2 ⁺ tumori primari ^19-21. Tuttavia, questi studi suggeriscono che Herceptin può essere essendo sub-ottimale utilizzati e che la caratterizzazione CTC può essere di aiuto nel predire la risposta al trattamento. In ultima analisi, caratterizzazione CTC può avere il potenziale per migliorare la cura personalizzata.

La ricerca CTC è unico in quanto ha in gran parte utilizzato un approccio capezzale a banco. Questo metodo, a differenza di banco-to-capezzale di ricerca, che spesso può richiedere anni per urtare la cura del paziente, ha permesso CTC rapida entrata in ambito clinico. Tuttavia, i medici sono riluttanti a utilizzare i risultati dell'analisi CTC nel trattamento dei pazienti dei processi decisionalizione a causa di una mancanza di comprensione della loro biologia sottostante. Pertanto appropriati modelli preclinici murini di tecniche di metastasi e complementari analisi CTC devono essere utilizzati al fine di indagare su queste questioni in sospeso. In generale, esistono due tipi di modelli preclinici utilizzati per studiare la cascata metastatica, (1) modelli metastasi spontanea, che permettono lo studio di tutti i passaggi della cascata metastatica, e (2) modelli metastasi sperimentali, che consentono soltanto lo studio delle successive fasi del processo metastatico come stravaso e formazione del tumore secondario ^22. Modelli metastasi spontanee, coinvolgono iniezioni di cellule tumorali in opportune sedi ortotopico (ad esempio iniezione di cellule tumorali della prostata nella prostata per lo studio del cancro alla prostata). Le cellule sono poi dato tempo per formare tumori primari e spontaneamente metastatizzare siti secondari come l'osso, polmone e linfonodi. Incontrasto, modelli metastasi sperimentali implicano l'iniezione diretta di cellule tumorali nel sangue (ad esempio via vena caudale o iniezione intracardiaca per indirizzare le cellule a posizioni specifiche) e quindi saltare le fasi iniziali di intravasation e diffusione di organi secondari ^22. Finora la maggior parte delle analisi CTC in in vivo sistemi modello è stato eseguito utilizzando sia basato ^{citometria-23} o adattate tecniche CTC basato umane (ad es AdnaTest) ^24. Anche se utile, nessuna di queste tecniche riflette adeguatamente CTC censimento utilizzando il CSS gold standard. Sulla base del riconoscimento clinico, natura standardizzata, e l'utilizzo diffuso di CSS, lo sviluppo di una cattura e rilevazione tecnica CTC in vivo modellazione che utilizza preparazione del campione equivalente, elaborazione e criteri di identificazione sarebbe vantaggiosa risultati sarebbero paragonabili a quelli ottenuti da campioni di pazienti. Tuttavia, a causa del volume di requirements dello strumento preparazione non è possibile realizzare piccoli volumi di sangue usando questa piattaforma automatizzata. . Inoltre, il lavoro precedente di Eliane et al ²⁵ ha dimostrato che la contaminazione dei campioni con le cellule epiteliali del mouse (che soddisfano anche la definizione standard CTC [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-]) può portare ad errori di classificazione delle cellule epiteliali squamose del mouse come CTC. Per affrontare questi problemi una tecnica adattata che permette l'utilizzo del kit reagenti CSS CTC unita ad una procedura di isolamento manuale è stato sviluppato. L'aggiunta di un FITC marcato antigene leucocitario umano (HLA) anticorpo per il saggio permette alle cellule tumorali umane di distinguerli da cellule epiteliali squamose mouse.

Questo manoscritto descrive lo standard, sviluppata commercialmente e il protocollo CSS ottimizzato per la lavorazione di campioni di sangue e le insidie ​​più comuni che si possono riscontrare, tra cui discrepanzeelementi t che possono portare ad errori di classificazione CTC. Inoltre, la personalizzazione del dosaggio CSS esaminare caratteristiche proteiche definite dall'utente CTC catturate e una tecnica analoga CSS adattato che permette l'arricchimento e rilevamento delle CTC da piccoli volumi di sangue in modelli preclinici murini di metastasi sono descritti.

Protocol

Tutti gli studi umani descritti in questo manoscritto sono state effettuate secondo protocolli approvati da Research umano Comitato Etico della Western University. Tutti sono stati condotti studi su animali in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese per la cura degli animali, secondo protocolli approvati dalla Western University uso di animali sottocommissione. 1. Standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue Utilizzo del CSS 1. Sangue uman…

Representative Results

Standard CTC Enumerazione Assay La sensibilità e la specificità del CSS è stata ben documentata in letteratura. Tuttavia, per validare il recupero CTC equivalente a spillo (cellule tumorali della prostata umana 1.000 LNCaP) e campioni di sangue umano unspiked da donatori volontari sani sono stati elaborati sulla CSS utilizzando il protocollo CSSCTC standard. Come previsto, i campioni unspiked erano liberi di CTC, 0.00 ± 0.00%, e il recupero CTC è stata dimostrata essere 86,9 ± 4,71% per i…

Discussion

Nonostante lo sviluppo di molte nuove tecnologie CTC dopo l'introduzione del CSS nel 2004, questa tecnica è ancora l'unica tecnologia clinicamente approvato oggi sul mercato e, pertanto, è considerato il gold standard attuale per la rilevazione CTC e l'enumerazione. Questo manoscritto ha dimostrato che, sebbene il CSS ha standard rigoroso controllo di qualità può essere soggetto a bias di interpretazione e che l'identificazione CTC nei campioni dei pazienti è molto diverso da identificazione in camp…

Materials

REAGENTS
0.5M EDTA
Anti-human CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
Anti-human CD44-PE	BD Pharmigen	555479
Anti-human HLA-AlexaFluor488	BioLegend	311415
Anti-mouse CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent	Leica	AR9352
CellSave Preservative Tubes	Veridex	952820 (20 pack)                      79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit	Veridex	7900003
CellSearch CTC Kit	Veridex	7900001
CellSearch CXC Control Kit	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC Kit	Veridex	7900017RUO
Instrument Buffer	Veridex	7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)	Streck	213350
EQUIPMENT
1 ml syringe
10 ml serological pipette
1000µl pipette
1000µl pipette tips
12 x 75mm flow tubes
200µl gel loading tips
200µl pipette
22 gauge needle
5 3/4" disposible pasteur pipet	VWR	14672-200
5 ml serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)	BD Microtainer	365974
CellSearch Analyzer II	Veridex	9555	Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System	Veridex	9541
Centrifuge
MagCellect Magnet	R&D Systems	MAG997
Small Latex Bulb	VWR	82024-550
Vortex