Tilpasning av semiautomated Sirkulasjons Tumor Cell (CTC) Analyser for klinisk og preklinisk forskning Applications

Summary

Sirkulerende tumorceller (CTCs) er prognostisk i flere metastatisk kreft. Dette manuskriptet beskriver gullstandarden CellSearch system (CSS) CTC opplisting plattform og høydepunkter vanlige feilklassifisering feil. I tillegg er to tilpasset protokoller beskrevet for brukerdefinert markør karakterisering av CTCs og CTC oppregning i prekliniske musemodeller av metastasering ved hjelp av denne teknologien.

Abstract

Flertallet av kreftrelaterte dødsfall forekommer i etterkant av utviklingen av metastatisk sykdom. Denne svært dødelig sykdom trinn er forbundet med nærværet av sirkulerende tumorceller (CTCS). Disse sjeldne celler har vist seg å være av klinisk betydning i metastatisk brystkreft, prostatakreft og kolorektal kreft. Dagens gullstandard i klinisk CTC deteksjon og telling er FDA-ryddet CellSearch system (CSS). Dette manuskriptet skisserer standard protokoll benyttes av denne plattformen, samt to ekstra tilpasset protokoller som beskriver den detaljerte prosessen med brukerdefinert markør optimalisering for protein karakterisering av pasient CTCs og en tilsvarende protokoll for CTC-fangst på svært lave volumer av blod, ved hjelp av standard CSS reagenser, for å studere i vivo prekliniske musemodeller av metastasering. I tillegg forskjeller i CTC kvalitet mellom frisk donor blod tilsatt celler fra vev kultur versus pasient blod SAMPles er uthevet. Til slutt, er flere vanlige avvik elementer som kan føre til CTC feilklassifisering feil skissert. Til sammen vil disse protokollene gi en nyttig ressurs for brukere av denne plattformen interessert i preklinisk og klinisk forskning knyttet til metastasering og CTCs.

Introduction

I 2013 er det anslått at 580 350 personer vil dø av kreft og at 1.660.290 nye tilfeller av denne sykdommen vil bli diagnostisert i USA alene ^en. De fleste av disse dødsfallene skjer i etterkant av utviklingen av metastatisk sykdom ^to. Dagens mangel på effektive behandlingsformer i behandling av metastaser og en begrenset forståelse av metastatisk kaskade gjør dette stadiet av sykdommen svært dødelig. Tilstedeværelsen av sirkulerende tumorceller (CTCS) i blodet har blitt vist å korrelere med metastatisk sykdom ^3.. Disse cellene er ekstremt sjeldne og deres oppdagelse er et tegn på total overlevelse i metastatisk brystkreft ^4, prostata ^5, og tykktarms ⁶ kreft. Hos disse pasientene ≥ 5 (bryst og prostata) eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod er tilstedeværelsen av et tegn på dårligere prognose i forhold til pasienter med færre eller ingen påvisbare CTCs i same blodvolum. I tillegg, er endringen i CTC antall under eller etter terapeutisk intervensjon blitt vist å være nyttig som en prediktor for behandling respons, ofte raskere enn for tiden utnyttes teknikker ^7-10.

Det har blitt anslått at i metastatiske kreftpasienter, CTCs inntreffer med en frekvens på omtrent 1 CTC per 10 ⁵ -10 ⁷ blod mononukleære celler og hos pasienter med lokalisert sykdom, kan denne frekvensen bli enda lavere (~ 1 i 10 ^8). Den sjeldne natur av disse celler kan gjøre det vanskelig å nøyaktig og pålitelig detektere og analysere CTCs ^11.. Flere metoder (gjennomgått tidligere ^12-14) er blitt anvendt for å berike og detektere disse cellene ved å utnytte egenskaper som skiller dem fra omkring blodkomponenter. Generelt er CTC oppregning en prosess i to deler som krever både en berikelse trinn, og en deteksjonstrinn. Tradisjonelt berikelse trinn avhengige forskjeller i PhysiCal egenskaper CTCs (celle størrelse, tetthet, formbarhet) eller på protein markør uttrykk (dvs. epithelial celleadhesjonsmolekylet [EpCAM], cytokeratin [CK]). Etter anrikning kan CTC deteksjon utføres på en rekke forskjellige måter, den mest vanlige av disse er nukleinsyre-baserte analyser og / eller cytometriske metoder. Hver av disse strategiene er unike, har klare fordeler og ulemper, men de alle mangler standardisering, en nødvendighet for inngangen til klinisk setting. Den CellSearch system (CSS) ble derfor utviklet for å gi en standardisert metode for påvisning og telling av sjeldne CTCs i menneskelig blod ved hjelp av fluorescens mikroskopi og antistoffbaserte teknikker ^4-6. Denne plattformen er for tiden regnet som gullstandarden i CTC oppregning og er den eneste teknikken godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for bruk i klinikken ^15.

CSS er en to-komponent plattform consisting, (1) den CellTracks AutoPrep system (heretter referert til som preparat instrument), som automatiserer fremstilling av humane blodprøver, og (2) den CellTracks Analyzer II (heretter referert til som analyseapparatet), som skanner disse prøver følgende forberedelser. For å skille CTCs forurenser leukocytter utarbeidelse instrument sysselsetter et antistoff mediert, ferrofluid basert magnetisk separasjon tilnærming og differensial fluorescensbeising. I utgangspunktet etiketter systemet CTCs bruker anti-EpCAM antistoffer konjugert til jern nanopartikler. Prøven blir deretter inkubert i et magnetisk felt, og alle umerkede celler blir aspirert. Valgte tumorceller blir resuspendert og inkubert i en differensial fluorescens beis, som består av fluorescensmerket-merkede antistoffer og en nukleær farging reagens. Til slutt blir prøven overført til en magnetisk patron, kalt en MagNest (heretter referert til som den magnetiske enhet), og scanned ved hjelp av analyseinstrumentet.

Analysen instrument blir brukt til å skanne preparerte prøver ved bruk av forskjellige fluorescens-filtre, hvert er optimalisert til passende fluorescerende partikler, ved hjelp av et 10X objektiv. CTCs er identifisert som celler som er bundet av anti-EpCAM, anti-pan-CK-fysoerytrin (PE) (CK8, 18, og 19), og den kjernefysiske beis 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Omvendt er forurensende leukocytter identifisert som celler som er bundet ved anti-CD45-allophycocyanin (APC) og DAPI. Etter skanning, er datadefinerte potensielle kreftceller presenteres for brukeren. Fra disse bildene, må brukeren benytte kvalitativ analyse ved hjelp av de definerte parametere og differensialfarging diskutert ovenfor for å bestemme hvilke hendelser er CTCs.

I tillegg til å gi en standardisert metode for CTC oppregning, gjør at CSS for molekylær karakterisering av CTCs basert på protein markører av interesse. Dette avhør cen bli utført på enkeltcelle-nivå, ved hjelp av et fluorescein isothiocyanat (FITC) fluorescens-kanalen ikke er nødvendig for identifikasjon CTC ^16.. Selv om denne plattformen gir kapasitet for molekylær karakterisering, den detaljerte prosessen med protokoll utvikling og optimalisering er ikke godt definert. Tre kommersielt tilgjengelige markører er blitt utviklet av fabrikanten for anvendelse med CSS, inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2) og insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R). HER2 analyse, i kombinasjon med CSS, har blitt benyttet av flere grupper for å illustrere potensialet for CTC karakterisering å informere kliniske beslutninger og å potensielt endre eksisterende retningslinjer for behandling. For eksempel, Fehm et al. ¹⁷ viste at om lag en tredel av brystkreftpasienter med HER2-primære svulster hadde HER2 ⁺ CTCs. I tillegg, Liu et al.18 nylig rapportert at opptil 50% av pasienter med henne ⁺ metastatisk brystkreft ikke har HER2 ⁺ CTCs. Herceptin, en HER2 reseptor forstyrrer monoklonalt antistoff viste til stor nytte pasienter med tumorer uttrykke tilstrekkelig nivå av HER2, er en ofte benyttet behandling for pasienter med HER2 ⁺ primære svulster ^19-21. Men disse studiene tyder på at Herceptin kan være sub-optimalt utnyttet og at CTC karakterisering kan hjelpe til å forutsi behandlingsrespons. I siste instans kan CTC karakterisering har potensial til å forbedre personlig omsorg.

CTC forskning er unik i at det har i stor grad benyttet en sengekanten-til-bord tilnærming. Denne metoden, i motsetning til stasjonære maskiner til sengen forskning, noe som ofte kan ta år å påvirke pasientbehandlingen, har tillatt CTCs rask inntreden i klinisk setting. Men leger er nølende til å bruke resultater fra CTC analyse i pasientbehandling beslutningsing på grunn av en manglende forståelse av deres underliggende biologi. Derfor egnede prekliniske musemodeller av metastasering og utfyllende CTC analyseteknikker må utnyttes for å undersøke disse utestående spørsmålene. Generelt er det to typer av prekliniske modeller som brukes for å studere metastatisk kaskade, (1) spontan metastase modeller, som gir mulighet for studiet av alle trinnene i den metastatisk kaskade, og (2) eksperimentelle metastase modeller, som kun tillater studiet av de senere trinn i prosessen slik som metastatisk ekstravasasjon og sekundær tumordannelse ^22.. Spontane metastase modeller, involvere tumorcelle injeksjoner i egnede ortotopiske steder (f.eks injeksjon av prostata kreft celler i prostatakjertelen for studiet av prostatakreft). Celler blir deretter gitt tid til å danne primære tumorer og spontant metastasere til sekundære steder som ben, lunge, og lymfeknuter. Ikontrast, eksperimentelle metastase modeller bære direkte injeksjon av kreftceller i blodet (f.eks via halen blodåre eller intrakardiell injeksjon for å målrette celler til bestemte steder), og dermed hoppe over de første trinnene av intravasation og formidling til sekundære organer ^22. Så langt de fleste av CTC analyse i in vivo modellsystemer har blitt utført ved hjelp av enten cytometry-baserte ²³ eller tilpasset menneskebasert CTC teknikker (f.eks AdnaTest) ^24. Selv nyttig, ingen av disse teknikkene tilstrekkelig reflektere CTC oppregning hjelp gullstandarden CSS. Basert på klinisk godkjenning, standardisert natur, og utbredt bruk av CSS, vil utviklingen av en CTC-fangst og påvisning teknikk for in vivo modellering som benytter tilsvarende prøveopparbeidelse, prosessering, og identifikasjonskriterier være en fordel som resultatene ville være sammenlignbare med de hentet fra pasientprøver. Imidlertid, på grunn av volumet requirements i preparatet instrumentet er det ikke mulig å bearbeide små mengder blod ved hjelp av denne automatiske plattformen. . I tillegg har tidligere arbeidet ved Eliane et al ²⁵ viste at forurensning av prøver med musen epitelceller (som også oppfyller standarden CTC definisjon [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-]) kan føre til feilklassifisering av mus squamous epitelceller som CTCs. For å løse disse problemene en tilpasset teknikk som gjør at utnyttelse av CSS CTC kitreagenser kombinert med en manuell isolasjon prosedyren ble utviklet. Tilsetningen av et FITC-merket humant leukocyttantigen (HLA) antistoff til analysen tillater humane tumorceller som skal skilles fra mus squamous epitelceller.

Dette manuskriptet beskriver standard, kommersielt utviklet og optimalisert CSS protokoll for behandling av pasientblodprøver og vanlige fallgruvene som kan oppstå, inkludert discrepant elementer som kan føre til CTC feilklassifisering feil. I tillegg blir tilpasning av CSS analyse for å undersøke brukerdefinerte protein karakteristikker av fangede CTCs og en tilsvar innrettet CSS teknikk som gjør det mulig for anriking og påvisning av CTCs fra små volumer av blod i prekliniske musemodeller av metastasering beskrevet.

Protocol

Alle studier på mennesker som er beskrevet i dette manuskriptet ble utført under protokoller godkjent av Western University Human forskningsetikk Board. Alle Dyrestudier ble utført i tråd med anbefalingene fra den kanadiske rådet på Animal Care under protokoller godkjent av Western University Animal Bruk Subcommittee. En. Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS En. Human Blood Prøvetaking og klargjøring for prosessering på Forberedels…

Representative Results

Standard CTC Enumeration analysen Sensitiviteten og spesifisiteten av CSS er godt dokumentert i litteraturen. Men for å validere tilsvar CTC utvinning, piggete (1000 LNCAP menneskelig prostata kreft celler) og unspiked humane blodprøver fra friske frivillige givere ble behandlet på CSS ved hjelp av standard CSSCTC protokollen. Som forventet, unspiked prøvene var fri for CTCs, 0,00 ± 0,00%, og CTC utvinning ble vist å være 86,9 ± 4,71% for piggete prøver (Figur 1a). CSS…

Discussion

Til tross for utviklingen av mange nye CTC teknologier siden innføringen av CSS i 2004, er denne teknikken fortsatt den eneste klinisk godkjent teknologien på markedet i dag, og derfor er det anses dagens gullstandard for CTC deteksjon og telling. Dette manuskriptet har vist at selv om CSS har strenge kvalitetskontroll standarder kan det være gjenstand for fortolkning skjevhet og at CTC identifikasjon i pasientprøver er mye forskjellig fra identifikasjon i piggete prøver. Det ble identifisert seks kategorier av all…

Materials

REAGENTS
0.5M EDTA
Anti-human CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
Anti-human CD44-PE	BD Pharmigen	555479
Anti-human HLA-AlexaFluor488	BioLegend	311415
Anti-mouse CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent	Leica	AR9352
CellSave Preservative Tubes	Veridex	952820 (20 pack)                      79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit	Veridex	7900003
CellSearch CTC Kit	Veridex	7900001
CellSearch CXC Control Kit	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC Kit	Veridex	7900017RUO
Instrument Buffer	Veridex	7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)	Streck	213350
EQUIPMENT
1 ml syringe
10 ml serological pipette
1000µl pipette
1000µl pipette tips
12 x 75mm flow tubes
200µl gel loading tips
200µl pipette
22 gauge needle
5 3/4" disposible pasteur pipet	VWR	14672-200
5 ml serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)	BD Microtainer	365974
CellSearch Analyzer II	Veridex	9555	Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System	Veridex	9541
Centrifuge
MagCellect Magnet	R&D Systems	MAG997
Small Latex Bulb	VWR	82024-550
Vortex