Anpassning av halvautomatiserad cirkulerande tumör Cell (CTC) Analyser för klinisk och preklinisk forskning Applications

Summary

Cirkulerande tumörceller (CTCs) är prognostiska i flera metastaserande cancer. Detta manuskript beskriver guldmyntfoten Cellsearch systemet (CSS) CTC uppräkning plattform och höjdpunkter gemensamma klassificeringsfel fel. Dessutom är två anpassade protokoll beskrivs för användardefinierad markör karakterisering av CTCs och CTC uppräkning i prekliniska musmodeller av metastaser med hjälp av denna teknik.

Abstract

Huvuddelen av cancerrelaterade dödsfall inträffar efter utveckling av metastatisk sjukdom. Denna mycket dödlig sjukdom steg är förknippat med förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs). Dessa sällsynta celler har visat sig vara av klinisk signifikans i metastaserande bröst-, prostata-och kolorektal cancer. Den nuvarande guldmyntfot i klinisk CTC detektering och räkning är FDA-godkänt Cellsearch systemet (CSS). Detta manuskript beskriver standardprotokoll som används av denna plattform samt ytterligare två anpassade protokoll som beskriver den detaljerade processen för användardefinierad markör optimering för proteinkarakterisering av patient CTCs och ett jämförbart protokoll för CTC fånga i mycket låga volymer av blod, med vanliga CSS-reagens, för att studera in vivo prekliniska musmodeller av metastaser. Dessutom kan skillnader i CTC kvalitet mellan frisk givare blod spetsades med celler från vävnadskultur kontra patientblod samples är markerade. Slutligen, finns flera allmänt avvikande poster som kan leda till CTC klassificeringsfel fel beskrivs. Sammantaget kommer dessa protokoll utgör en användbar resurs för användare av denna plattform är intresserade av preklinisk och klinisk forskning avseende metastaser och CTCs.

Introduction

År 2013 beräknas det att 580.350 personer kommer att dö i cancer och att 1.660.290 nya fall av denna sjukdom kommer att diagnostiseras i USA ensamt ^1. De flesta av dessa dödsfall inträffar efter utveckling av metastatisk sjukdom ^2. Den nuvarande bristen på effektiva behandlingar vid behandling av metastaser och en begränsad förståelse för metastaserande kaskad gör detta skede av sjukdomen mycket dödlig. Förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs) i blodomloppet har visat sig korrelera med metastaserad sjukdom ^3. Dessa celler är extremt sällsynta och deras upptäckt är ett tecken på total överlevnad vid metastaserande bröstcancer ^4, prostata ^5, och kolorektal ⁶ cancer. Hos dessa patienter, ≥ 5 (bröst och prostata) eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod är förekomsten av tecken på sämre prognos jämfört med patienter med färre eller inga detekterbara CTCs i same blodvolym. Dessutom har förändringen av CTC antal under eller efter terapeutisk behandling visat sig vara användbar som en prediktor för behandlingssvar, ofta tidigare än för närvarande utnyttjas tekniker ^7-10.

Det har uppskattats att det i metastaser cancerpatienter, CTCs inträffar med en frekvens på ca 1 CTC per 10 ⁵ -10 ⁷ mononukleära blodceller och hos patienter med lokaliserad sjukdom, kan denna frekvens vara ännu lägre (~ 1 i 10 ^8). Den sällsynta karaktären av dessa celler kan göra det svårt att exakt och pålitligt upptäcka och analysera CTCs ^11. Flera metoder (omdömet tidigare ^12-14) har använts för att berika och upptäcka dessa celler genom att utnyttja egenskaper som skiljer dem från omgivande blodkomponenter. I allmänhet är CTC uppräkning en process i två delar som kräver både en anrikningssteg och ett detekteringssteg. Traditionellt anrikningssteg är beroende av skillnader i fystiska egenskaper CTCs (cellstorlek, densitet, deformerbarhet) eller på proteinmarkör expression (dvs. epitelial celladhesionsmolekyl [EpCAM], cytokeratin [CK]). Efter anrikning kan CTC detektering utföras på ett antal olika sätt, är den vanligaste av dessa är nukleinsyra-baserade analyser och / eller cytometrisk tillvägagångssätt. Var och en av dessa strategier är unika, med olika fördelar och nackdelar, men de alla saknar standardisering, en nödvändighet för inträde i klinisk miljö. Den Cellsearch systemet (CSS) har därför utvecklats för att ge en standardiserad metod för detektion och räkning av sällsynta CTCs i blod med hjälp av fluorescensmikroskopi och antikroppsbaserade metoder ^4-6. Denna plattform är för närvarande anses vara den högsta standarden inom CTC uppräkning och är den enda teknik som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) för användning i kliniken ^15.

CSS är en tvåkomponents plattform consisting, (1) den CellTracks autoprep.-systemet (nedan kallad framställning instrument), som automatiserar framställning av humana blodprov, och (2) den CellTracks Analyzer II (i det följande kallad analys instrument), som läser av dessa prov efter beredning. För att skilja CTCs förorenar leukocyter beredningen Instrumentet är en antikroppsmedierad, ferrofluid baserad magnetisk separation strategi och differentialfluorescensfärgning. Initialt märker systemet CTCs använda anti-EpCAM antikroppar konjugerade till järn nanopartiklar. Provet inkuberas sedan i ett magnetfält, och alla omärkta celler aspireras. Valda tumörcellerna återsuspenderas och inkuberas i en differential fluorescens fläck, som består av fluorescensmärkta antikroppar och en nukleär färgning reagens. Slutligen provet överfördes till en magnetisk patron, som kallas en MagNest (hädanefter kallad den magnetiska anordningen) och scanned använder analysinstrumentet.

Analysinstrumentet används för att skanna framställda proverna med användning av olika fluorescensfilter, vart och ett optimerat för att den lämpliga fluorescerande partikel, med användning av ett 10X objektiv. CTCs identifieras som celler som är bundna av anti-EpCAM, anti-pan-CK-fykoerytrin (PE) (CK8, 18, och 19), och den nukleära fläck 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Omvänt är kontaminerande leukocyter identifierade som celler som är bundna av anti-CD45-allofykocyanin (APC) och DAPI. Efter skanning, är datordefinierade potentiella tumörceller presenteras för användaren. Från dessa bilder, måste användaren använda kvalitativ analys med hjälp av de definierade parametrar och differentialfärgning som diskuterats ovan för att bestämma vilka händelser är CTCs.

Förutom att ge en standardiserad metod för CTC räkning, gör CSS för molekylär karakterisering av CTCs baserad på proteinmarkörer av intresse. Detta förhör cen utförs vid encelliga nivå, med användning av en fluorescein-isotiocyanat (FITC) i fluorescenskanal krävs inte för CTC identifiering ^16. Även denna plattform ger kapaciteten för molekylär karakterisering, den detaljerade processen för protokollutveckling och optimering är inte väldefinierad. Tre kommersiellt tillgängliga markörer har utvecklats av tillverkaren för användning med CSS, inklusive epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2) och insulin-liknande tillväxtfaktor 1-receptor (IGF-1R). HER2-analys i kombination med CSS, har utnyttjats av flera grupper för att belysa potentialen för CTC karakterisering att informera kliniskt beslutsfattande och att eventuellt ändra befintliga behandlingsriktlinjer. Exempelvis Fehm et al. ¹⁷ visade att ungefär en tredjedel av bröstcancerpatienter med HER2-primära tumörer hade HER2 ⁺ CTCs. Dessutom Liu et al.18 rapporterade nyligen att upp till 50% av patienter med HER ⁺ metastaserad bröstcancer inte hade HER2 ⁺ CTCs. Herceptin, en HER2-receptorn störande monoklonal antikropp visat att kraftigt gynna patienter vars tumörer uttrycker tillräckliga nivåer av HER2, är en vanligen använd behandling för patienter med HER2 ⁺ primära tumörer ^19-21. Dessa studier tyder på att Herceptin kan vara sub-utnyttjas optimalt och att CTC karakterisering kan hjälpa till att förutsäga behandlingssvar. I slutändan kan CTC karakterisering har potential att förbättra personlig vård.

CTC forskning är unikt genom att det i stort sett utnyttjat en säng-till-bänk strategi. Denna metod, till skillnad från bänk till sängen forskning, som ofta kan ta år att påverka patientvården, har gjort CTCs snabbt inträde i klinisk miljö. Men läkarna är tveksamma till att använda resultaten från CTC-analys i patientbehandling beslutsfattning på grund av en brist på förståelse för den underliggande biologin. Därför lämpliga prekliniska musmodeller av metastaser och kompletterande CTC analystekniker måste utnyttjas för att undersöka dessa utestående frågor. Generellt finns det två typer av prekliniska modeller som används för att studera metastaser kaskad, (1) spontan metastaser modeller, som möjliggör studier av alla steg i metastaserande kaskad, och (2) experimentella metastaser modeller, som endast tillåter studiet av senare steg i metastaserande process, såsom extravasation och sekundära tumörbildning ^22. Spontan metastas modeller, involverar tumörcellinjektioner i lämpliga orthotopic platser (t.ex. insprutning av prostatacancerceller i prostatakörteln för studien av prostatacancer). Cellerna ges sedan tid att bilda primära tumörer och spontant metastasera till sekundära platser såsom ben, lungor och lymfkörtlar. IDäremot experimentella metastaser modeller innebär direkt injektion av tumörceller i blodet (t.ex. via svansvenen eller intrakardiell injektion till målceller till specifika platser) och därmed hoppa över de inledande stegen i intravasation och spridning till sekundära organ ^22. Hittills majoriteten av CTC-analys i in vivo modellsystem har utförts med hjälp av antingen cytometry-baserade ²³ eller anpassade CTC tekniker mänskliga baserade (t.ex. AdnaTest) ^24. Även användbar, ingen av dessa tekniker återspeglar adekvat CTC uppräkning med hjälp av guldmyntfoten CSS. Baserat på den kliniska godkännande, standardiserad karaktär, och utbredd användning av CSS, skulle utvecklingen av en CTC fånga och upptäcka teknik för in vivo-modeller som använder provberedning motsvarande, bearbetning, och kriterier för identifiering vara fördelaktigt eftersom resultaten skulle vara jämförbara med dem erhölls från patientprover. Men på grund av den volym requirements av preparatets instrument är det inte möjligt att behandla små volymer av blod med hjälp av denna automatiserad plattform. . Dessutom har tidigare arbetet med Eliane et al ²⁵ visade att kontaminering av prover med musen epitelceller (som också uppfyller standarden CTC definition [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-]) kan leda till felaktig klassificering av mus skivepitelcancer epitelceller som CTCs. För att hantera dessa frågor en anpassad teknik som möjliggör utnyttjandet av CSS CTC kitreagenser i kombination med en manuell isoleringsförfarande utvecklades. Tillsättning av en FITC-märkt human leukocyt antigen (HLA) antikroppen till analysen möjliggör humana tumörceller som skall särskiljas från mus skvamösa epitelceller.

Detta manuskript beskriver standard kommersiellt utvecklats och optimerats CSS protokoll för bearbetning av patientens blodprov och vanliga fallgropar som kan uppstå, inklusive discrepant ex som kan leda till CTC klassificeringsfel fel. Dessutom är anpassning av CSS-analysen för att undersöka användardefinierade proteinegenskaper fångade CTCs och jämförbar anpassade CSS-teknik som gör det möjligt för anrikning och detektion av CTCs från små volymer av blod i prekliniska djurmodeller för metastaser beskrivs.

Protocol

Alla studier på människa som beskrivs i detta manuskript utfördes under protokoll som godkänts av Western University s Human forskningsetik Board. Samtliga Djurstudier har utförts i enlighet med rekommendationerna från det kanadensiska rådet om Animal Care, enligt protokoll som godkänts av Western University Animal Användning utskottet. 1. Standard CTC Uppräkning från patientblodprover med CSS 1. Människoblod Provtagning och förberedelse för bearbetning …

Representative Results

Standard CTC Enumeration Assay Känsligheten och specificiteten hos CSS är väl dokumenterade i litteraturen. Men för att validera motsvarande CTC återhämtning, spetsade (1.000 LNCaP mänskliga prostatacancerceller) och ospetsade humana blodprover från friska frivilliga givare behandlades på CSS med hjälp av standard CSSCTC protokollet. Som väntat ospetsade prover var fria från CTCs, 0,00 ± 0,00%, och CTC återhämtning visade sig vara 86,9 ± 4,71% för spetsade prover (Figur…

Discussion

Trots utvecklingen av många nya CTC teknik sedan införandet av CSS i 2004, är denna teknik fortfarande den enda kliniskt godkänd teknik på marknaden idag, och därför anses den nuvarande standarden för CTC upptäckt och kvantifiering. Detta manuskript har visat att även om CSS har rigorösa kvalitetskontroll kan det vara föremål för tolkning partiskhet och att CTC identifikation i patientprover är mycket annorlunda från identifiering i spetsade prover. Sex kategorier av allmänt avvikande poster identifiera…

Materials

REAGENTS
0.5M EDTA
Anti-human CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
Anti-human CD44-PE	BD Pharmigen	555479
Anti-human HLA-AlexaFluor488	BioLegend	311415
Anti-mouse CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent	Leica	AR9352
CellSave Preservative Tubes	Veridex	952820 (20 pack)                      79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit	Veridex	7900003
CellSearch CTC Kit	Veridex	7900001
CellSearch CXC Control Kit	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC Kit	Veridex	7900017RUO
Instrument Buffer	Veridex	7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)	Streck	213350
EQUIPMENT
1 ml syringe
10 ml serological pipette
1000µl pipette
1000µl pipette tips
12 x 75mm flow tubes
200µl gel loading tips
200µl pipette
22 gauge needle
5 3/4" disposible pasteur pipet	VWR	14672-200
5 ml serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)	BD Microtainer	365974
CellSearch Analyzer II	Veridex	9555	Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System	Veridex	9541
Centrifuge
MagCellect Magnet	R&D Systems	MAG997
Small Latex Bulb	VWR	82024-550
Vortex