이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.
여러 프로세스의 mRNA와 단백질의 전사, 번역 및 안정성 등의 유전자 발현에 참여하고 있습니다. 각 단계가 밀접하게 단백질 풍요의 최종 역학에 영향을 미치는 규제하고 있습니다. 각종 규제 메커니즘 단독 유전자 발현의 불안정한 표시기 mRNA 수준 렌더링, 변환 단계에서 존재한다. 또한, mRNA의 번역의 지역 규제는 특히 신경 생물학에 관심의 초점을 'translatomics'을 이동, 신경 세포의 기능에 연루되어있다. 제시된 방법은 다리의 transcriptomics 및 프로테오믹스에 사용할 수 있습니다.
여기에서 우리는 여러 리보솜에 적극적으로 번역의 mRNA 협회 및 자당 기울기에서의 차등 침강에 따라 translatome를 심문 polyribosome 분별의 기술에 필수적인 수정을 설명합니다. 전통적으로, 특히 센트라의 생체 샘플 작업L 신경계 (CNS)에 의한 재료의 제한된 양의 지방 조직과 성분의 존재에 도전 입증되었다. 하나의 마우스 척수 및 뇌의 사용에 의해 설명되는 것과 같이이 문제를 해결하기 위해, 설명 된 프로토콜은 특별히 CNS 재료의 최소한의 사용하기 위해 최적화된다. 간단히, CNS 조직 추출하고 변환하는 리보솜은 사이클로 헥시 미드와의 mRNA에 고정되어있다. 수초 부상은 다음 지질이 풍부한 구성 요소를 제거하기 위해 수행된다. 분별은의 mRNA가 자신의 리보솜의 상태에 따라 분리 된 자당 기울기에서 수행됩니다. 고립 된 분수는 새로운 게놈 넓은 분석 기술을 포함하여 다운 스트림 분석의 범위에 적합하다.
유전자 발현은 번역이 가장 주된 효과 1 베어링과, 전사, 번역 및 mRNA와 단백질의 안정성의 결합 작용에 의해 결정된다. 이들 각 단계는 규제가 심한 것이 이제 분명하다. 마이크로 RNA를, RNA 과립, 대체 세포질 폴리아 데 닐화의 형성은 유전자 발현 2,3의 전사 후 조절의 몇 가지 예입니다. 이러한 메커니즘은 각각의 번역에서 전사를 분리됩니다 관심의 생물학적 시스템의 프로테옴에 영향을 미친다. 따라서, 당연히, 홀로 mRNA 수준은 단백질 수준 4의 불완전한 판독한다. 정량 프로테오믹스 그러나 최근의 진보에도 불구하고, 감도 및 단백질 서열 해결에 상당한 제한이 여전히있다, 유전자 발현의 가장 직접적인 평가를 제공합니다. 따라서 translatome 주소, 번역의 mRNA의 레퍼토리는, 공부를 잘 절충을 제공하는사체와 단백체. 그것은 최종 유전자 발현을 평가 transcriptomics보다 더 정확하고, 더 높은 범위와 프로테오믹스보다 시퀀스 해상도를 모두 제공합니다.
포유 동물 시스템에서, 번역 사건의 대다수는 캡 – 의존적 개시를 통해 시작된다. 함께 40S 작은 리보솜 소단위와 진핵 개시 인자의 그룹의 mRNA의 5 '캡에 조립합니다. 단지는 다음의 mRNA를 스캔하고 8월 코돈 시작에 도달하면, 완전한 80S 리보솜 형성하기 위해 60 년대 큰 리보솜 소단위를 모집합니다. 연신 단계는 리보솜 연신율 요인 초기 펩티드 쇄에로드 된 tRNA에서 아미노산의 혼입을 지원하여, mRNA를 따라 이동으로 진행한다. 다중 리보솜 동시에 하나의 mRNA를 따라 진행하고 연관된 리보솜 수가 단백질 합성 5,6의 속도와 상관 관계를 보였다. 이 리보솜 로딩 트란에 대한 신뢰할 수있는 표시를한다slation 적극적으로 침강 속도에 따라 mRNA가 번역을 분리 할 수 있습니다. mRNA를 번역의 정량화 이외에, 시퀀스 정보는 번역 조절에 관여 모티프를 식별하기 위해 얻어 질 수있다. 또한 결합 단백질 및 기타 번역 요인이 관련 규제 단백질의 연구와 발견을 촉진, 다른 분수에서 고립 될 수 RNA.
신경계에서 번역 컨트롤은 mRNA의 저장, 운송 및 지방 단백질 합성 등의 프로세스에 연결되어 있습니다. 성장 콘 축삭 7의 나머지 별개의 mRNA의 특정 지역화 풀 항구 보여왔다. 또, 축삭 단백질 로컬보기 8,9을 합성하는 기능을 갖는다. 그 결과, 번역의 지역 제어는 신경 생물학의 연구의 중요한 화제가되고있다. 이 문제를 해결하기 위해 polyribosome 분획의 전위는 기법을 사용 하였다, 몇몇 연구에 도시 한 내용척수 개발 축삭지도를 조사하고, 뇌의 10, 11에서 BDNF의 활동에 의존 번역을 보여 주었다.
polyribosome 분별이 새로운 기술은 아니지만, 그것은 특히 도전 하나가 남아있다. 입력 재료에 기초하는, 상당한 최적화가 필요할 수있다. 특히 재료의 양이 종종 조직 성분 변환의 mRNA의 분리를 방해 한정 및 지방산이며 생체 CNS 샘플에 대한 경우이다. 대부분의 출판 분별 프로토콜은 효모 또는 포유류 세포 라인을 처리하고, 뇌 12,13,14에 대한 설립 프로토콜이 있습니다. 대조적으로, 척수 분획을 설명하는 모든 출판물 간신히있어, 기존 프로토콜 (15)을 풀링하는 동물의 다수의 척수를 필요로한다. 이러한 이유로, 여러 가지 변형이 필수적인 하나의 마우스 척수 포함한 CNS 조직에 대해 분별 프로토콜을 적응되었다. 사이클로 헥시 미드와 리보솜 고정화는 운영 시간에만 리보솜의 분리를 방지하기 위해 동물 관류하는 동안 수행조직 추출 g의 긴 과정. 그 후, polysomal RNA를가 polyribosome 수율을 최대화하기 위해 특정 방식으로 추출된다. 첫째, douncing하여 조직의 균질화를 제어 그대로 핵을 유지하고 DNA 오염을 방지 할 수 있습니다. 핵은 다음 원심 분리하여 확실하게 제거된다. 세제 NP-40 및 나트륨 데 옥시 콜레이트의 조합은 소포체 막과 연관된 리보솜 동의서의 용해를 보장한다. 또한, 지질이 풍부한 미엘린 내의 UV-흡수 성분은 polyribosome 프로파일을 불명료. 이러한 폴리 리보솜과 같은 조밀 한 화합물 펠렛 등 수초 플로트와 같은 가벼운 화합물 (16)을 제거하는 곳 수초 부상은 필요가있다. 폴리 리보솜은 다음 17.5 % ~ 50 %의 자당 기울기에 침전된다. 대신 수동 각 자당 층 레이어링 및 동결 그라디언트는 그라데이션 혼합기를 사용하여 제조 될 수있다. 산성 페놀 / 클로로포름을 사용하여 분수에서 RNA의 추출 할 수 있습니다 DNA는 최소한의 RNA의 손실을 제거 할 수 있습니다. 그러나, 위상 반전 (일부 16 위) 밀도 자당 분수에서 발생할 수 있습니다.
이 프로토콜은 번역의 수준을 해결 기존의 다른 방법에 비해 장점을 제공한다. 예를 들어, 인산화 S6 (눈에 띄는 번역 마커)의 측정뿐만 아니라 방사성 동위 원소와 초기 체인의 라벨 모두 글로벌 번역 수준에 대한 정보를 제공하지만, 구체적으로 번역 된 내용에 조금 알 수있다. Polyribosome 분획 화는 반면에, 평가 해외 번역뿐만 아니라, 변환의 mRNA와 관련된 규제 단백질의 정체성 허용한다. 정량 실시간 PCR은 선택의 mRNA 중 빠른 읽기 격리 된 RNA를 수행 할 수 있으며, 마이크로 어레이 및 차세대 RNA 염기 서열은 게놈 넓은 연구를 수행 할 수 있습니다. 여기에 제시된 최적화 따라서 점감 기술은 CNS 조직의 최소량으로 사용될 수 있도록필요한 동물의 수를 보내고 조직 처리 시간을 감소시킴으로써 전체적인 실험적인 품질을 개선시킨다. 한편,이 기술은 번역하는 것과 실속 리보솜을 구별 할 수 없다. 실속 리보솜을 들고 성적 증명서는 무거운 분수에 침전하고, 데이터를 해석 할 때이 염두에 보관해야합니다.
리보솜은 세포 유형 특정 방식으로 각각 에피토프 태그 또는 기자로 표지 및 면역 (17, 18)에 의해 고립 된 mRNA가 연관되어있는 최근의보고 된 기술, 즉 RiboTaq 함정이있다. 이 기술은 특정 세포 집단에 대한 판독은 고해상도를 제공하는 분획을 polyribosome에 연결될 수있다. 리보솜 발 인쇄가 리보솜에 의해 보호됩니다의 mRNA의 또 다른 소설 작은 조각을 생성하는 핵산 분해 효소의 소화 관련 기술, 또는 "발자국"입니다. 라이브러리는 다음이 발자국의 생성 순서가됩니다. 이 방법의 prov에환산 코돈 고유 전체 게놈 분석 IDES과 실속 리보솜을 식별 할 수있는, 비 8월 코돈과 polyribosome 분획 (19)에 의해 달성 될 수없는 작은 상류 오픈 리딩 프레임을 시작한다. 그러나 polyribosome 분별 따라서 높은 샘플 순도이 종종 요구되는 라이브러리의 제조에 필요한 분자 종 풍요롭게 단일 리보솜을 포함하는 소화 단편의 분리를 위해 리보솜 프로파일에 연결될 수있다. 종합적 polyribosome 분획은 지속 유의성있는 유연한 방법 및 차세대 게놈 시퀀싱 같은 다양한 분석법 등 여러가지 어플리케이션 하류에 연결될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (BMBF), (시스템 생물학에 헬름홀츠 얼라이언스) 암의 시그널링의 시스템 생물학 및 독일 암 연구 센터 (DKFZ)에 의해 지원되었다.
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |