Denne protokollen illustrerer vesentlige modifikasjoner av polyribosome fraksjonering for å studere translatome av in vivo CNS-prøver. Den lar global vurdering av oversettelse og transkripsjon regulering gjennom isolasjon og sammenligning av total RNA til ribosom bundet RNA fraksjoner.
Flere prosesser er involvert i genekspresjon, inkludert transkripsjon, translasjon og stabilitet av mRNA og proteiner. Hvert av disse trinnene er strengt regulert, påvirker de endelige dynamikken i protein overflod. Ulike reguleringsmekanismer eksisterer på oversettelses trinn, rende mRNA nivåer alene en upålitelig indikator på genuttrykk. I tillegg har lokal regulering av mRNA oversettelse vært spesielt innblandet i nervefunksjoner, skiftende 'translatomics' til fokus for oppmerksomhet i nevrobiologi. Den presenterte metoden kan brukes til bridge transcriptomics og proteomikk.
Her beskriver vi viktige endringer i teknikken av polyribosome fraksjonering, som leser av translatome basert på foreningen av aktivt oversatte mRNA til flere ribosomer og deres differensial sedimentering i sakkarosegradienter. Tradisjonelt arbeider med in vivo prøver, særlig av Central nervesystemet (CNS), har vist seg vanskelig på grunn av de begrensede mengder av materiale og tilstedeværelsen av fettvev komponenter. For å løse dette, blir den beskrevne protokoll er spesielt tilpasset bruk med minimal mengde av CNS-materiale, som vist ved bruk av enkelt mus ryggmarg og hjerne. Kort fortalt er CNS vev hentet og sette ribosomer er immobilisert på mRNA med cycloheximide. Myelin flotasjon utføres deretter for å fjerne fettrike komponenter. Fraksjonering utføres på en sucrose-gradient, hvor mRNA er separert i henhold til deres ribosomal lasting. Isolerte fraksjoner er egnet for en rekke nedstrøms analyser, herunder nye genom bred analyseteknologi.
Gene expression er bestemt av den kombinerte virkning av transkripsjon, translasjon, og stabiliteten til mRNA og proteiner, med oversettelse bærer den mest dominerende virkning 1. Det er nå klart at hvert av disse trinnene er svært regulert. Micro-RNA, dannelsen av RNA granulater, alternativ og cytoplasmatisk polyadenylering er noen eksempler på post-transcriptional regulering av genuttrykk 2,3. Hver av disse mekanismer som kobler seg transkripsjon fra oversettelse og påvirker proteomet i det biologiske system av interesse. Dermed overraskende, mRNA nivåer alene er en ufullkommen avlesning av protein nivåer 4. Kvantitativ proteomikk gir den mest direkte vurdering av genekspresjon, men til tross for nylige fremskritt, er det fortsatt betydelige begrensninger på følsomhet og protein sekvens oppløsning. Derfor adressering translatome, repertoar sette mRNA, og tilbyr en utmerket kompromiss mellom å studeretranscriptome og proteom. Det er mer nøyaktig enn transcriptomics i vurderingen endelige genuttrykk, og gir både høyere dekning og sekvens oppløsning enn proteomikk.
I pattedyr systemer, begynner de fleste av oversettings hendelser via cap-avhengige innvielse. En gruppe av eukaryote initiering faktorer sammen med 40S lille ribosomale subenhet montere på 5 'cap av et mRNA. Komplekset skanner deretter mRNA og ved oppnådd startkodonet august, rekrutterer 60S store ribosomal subenhet å danne en komplett 80S ribosom. Forlengelses trinns-ding med ribosomet beveger seg langs mRNA, med forlengelsesfaktorer hjelpe inkorporeringen av aminosyrer fra belastede tRNAs til den begynnende peptid-kjeden. Flere ribosomer kan foregå langs en enkelt mRNA samtidig, og antallet tilknyttede ribosomer har vist seg å korrelere med graden av proteinsyntese 5,6. Dette gjør ribosomal lasting en pålitelig indikasjon for tranningen og tillater separasjon av aktivt sette mRNA basert på senkningsreaksjon. I tillegg til kvantifisering av sette mRNAs, kan sekvensinformasjon fås til å identifisere motiver som er involvert i oversettelse regulering. RNA Også bindingsproteiner og andre oversettelsesfaktorer kan isoleres fra forskjellige fraksjoner, å lette studiet og oppdagelse av relaterte regulatoriske proteiner.
I nervesystemet, og translasjonelle kontroll vært knyttet til prosesser som mRNA lagring, transport og lokal proteinsyntese. Vekst kjegler har vist seg å besitte en spesifikk lokal pool av mRNA distinkte fra resten av axon 7.. I tillegg aksoner har evnen til lokalt å syntetisere proteinene 8,9. Som et resultat, har lokal styring av oversettelses blitt et viktig tema for studien i nevrobiologi. Potensialet i polyribosome fraksjone for å løse dette er illustrert i flere studier, hvor teknikken ble anvendt for åundersøke axon veiledning i ryggmargen utvikling, og demonstrerte aktivitet avhengige oversettelse av BDNF i hjernen 10,11.
Selv polyribosome fraksjonering er ikke en ny metode, er det fortsatt en særlig utfordrende. Basert på innspill materiale, kan betydelig optimalisering være nødvendig. Dette er spesielt tilfellet for in vivo CNS-prøver, der mengden av materialet er ofte en begrensning og fettvev komponenter hindre isolasjon av sette mRNA. De publiserte fraksjoneringsprotokoller håndtere gjær-eller pattedyrcellelinjer, og det finnes etablerte protokoller for hjernen 12,13,14. I motsetning til dette er det knapt noen publikasjoner som beskriver fraksjonering av ryggmargen, og tidligere protokollene krever ryggmarg fra et stort antall dyr som skal sammenslåtte 15. Av disse grunner ble det gjort flere viktige modifikasjoner for å tilpasse den fraksjoneringsprotokoll for CNS-vev, inkludert enkelt mus ryggmarg. Ribosom immobilisering med cycloheximide er utført i løpet av dyr perfusjon å unngå dissosiasjon av ribosomer During den lange prosessen med vev utvinning. Deretter blir polysomal RNA ekstraheres på en bestemt måte for å maksimere polyribosome utbytte. Først kontrolleres homogenisering av vevet ved douncing, holder kjernen intakt og forhindrer DNA-kontaminering. Kjernen fjernes deretter på en pålitelig måte ved sentrifugering. Kombinasjonen av de vaskemidler NP-40 og natriumdeoksycholat sikrer lyse av det endoplasmatiske retikulum, og frigjøring av dens membran assosiert ribosomer. I tillegg, UV-absorberende komponenter i lipid rik myelin tilsløre polyribosome profiler. Myelin flotasjon er derfor nødvendig, hvor tette forbindelser såsom polyribosomes blir pelletert og lettere forbindelser slik som myelin flyte og blir fjernet 16.. Polyribosomes blir deretter sedimenteres i løpet av en 17.5% til 50% sakkarose-gradient. I stedet for manuelt lagdeling og frysing hver sukrose laget, kan gradienter også fremstilles under anvendelse av en gradient-blander. Utvinning av RNA fra fraksjoner som bruker surt fenol / kloroform tillater DNA fjernes med minimalt tap av RNA. Imidlertid kan faseinversjon inntreffe ved tette sukrose fraksjoner (nevnte fraksjon 16).
Denne protokollen gir fordeler i forhold til andre konvensjonelle fremgangsmåter som er rettet på nivået av translasjon. For eksempel, både måling av fosforylert S6 (en fremtredende oversettelse markør), samt merking av begynnende kjeder med radioisotoper gi informasjon om global oversettelse nivåer, men avslører litt om hva som konkret blir oversatt. Polyribosome fraksjonering, på den annen side, gjør det mulig ikke bare vurdering global oversettelse av, men også av identiteten til mRNA sette og de relaterte regulatoriske proteiner. Kvantitativ real-time PCR kan utføres på isolerte RNA for en rask lese ut av utvalgte mRNA, og mikromatriser og neste generasjon RNA sekvensering kan utføres for genom brede studier. Den optimaliseringer som presenteres her, tillater teknikken som skal benyttes med minimale mengder av CNS-vev, og derfor avtaring antall dyr er nødvendig og forbedre generelle eksperimentelle kvaliteten ved å redusere vev behandlingstiden. På den annen side, kan denne teknikken ikke skille stoppet ribosomer fra sette seg. Transkripsjoner frakter fastlåste ribosomer vil sedimentere i de tunge fraksjoner, og dette bør tas i betraktning ved tolkning av data.
Det er siste rapporterte teknikker, nemlig RiboTaq og felle, der ribosomer er merket med epitop tags eller journalister henholdsvis i en celletype bestemt måte og tilhørende mRNA isolert ved immunoprecipitation 17,18. Denne teknikken kan kobles til polyribosome fraksjone å tilby høy oppløsning lest opp for spesifikke cellepopulasjoner. Ribosom fot-utskrift er en annen roman teknikk som innebærer nuclease fordøyelsen å generere små fragmenter, eller "fotavtrykk", av mRNA som er beskyttet av ribosomer. Bibliotekene blir deretter generert fra disse fotsporene og sekvensert. Denne metoden provIdes et kodon spesifikke hele genomanalyse på oversettelse og er i stand til å identifisere fastlåste ribosomer, ikke-august starter kodon og små oppstrøms åpne leserammer, noe som ikke kan oppnås ved polyribosome fraksjone 19. Imidlertid kan polyribosome fraksjone kobles til ribosom profilering for isolering av fordøyde fragmenter inneholdende enkle ribosomer, således anrike for de molekylære arter som trengs for bibliotek-preparat hvor høy renhet prøven er ofte nødvendig. Til sammen er polyribosome fraksjone en fleksibel metode med varig betydning, og kan kobles til ulike nedstrøms applikasjoner, inkludert genom brede analyser som neste generasjons sekvensering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale Utdannings-og forskningsdepartementet (BMBF), Systems Biology of Signa i Cancer (Helmholtz Alliance på systembiologi) og den tyske Cancer Research Center (DKFZ).
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |