تقييم التخليص أكلة الموت الخليوي في السكتة الدماغية التجريبية قبل Ligatable نيون تحقيقات
Summary
نقدم تقنية جديدة لمضان انتقائية وضع العلامات الوضع الطبيعي للخلايا البلعمية النشطة في، والتي واضح من الجثث خلية في المخ. النهج المهم لتقييم رد فعل الدماغ لنقص التروية لأن نسبة صغيرة فقط من البالعات موجودة في الدماغ الدماغية المشاركة في تطهير موت الخلية.
Abstract
وصفنا نهج النسيجية جديدة لإزالة التصور البلعمية في التنسيق نقص تروية الدماغ. يسمح النهج دراسة القضاء على الخلايا الميتة في السكتة الدماغية عن طريق البالعات إدارة النفايات في أي النسب الخلوية. على الرغم من أن العديد من الخلايا من أصول مختلفة قادرة على البلعمة موجودة في الدماغ الدماغية، سوى جزء منهم تبتلع بنشاط وهضم الجثث الخلية. تصور انتقائي، الكمي وتحليل مثل هذه النشطة لإدارة النفايات أكلة مفيدة في تقييم استجابة الدماغ لنقص التروية. كفاءة التخليص موت الخلايا مهم للانتعاش الدماغ من الإصابة الدماغية، كما أنه يفتح الطريق أمام عمليات التجدد اللاحقة. ان فشل لتنظيف الجثث يؤدي إلى رد فعل السامة الناجمة عن الحمض النووي غير المتدهورة والبروتينات. يستخدم الإجراء الموضح تحقيقات الفلورسنت ligated بشكل انتقائي من قبل topoisomerase الفيروسي إلى DNA فواصل مميزة المنتجة في كل البالعات أثناء الغمروالهضم من الخلايا التالفة بشكل لا رجعة فيه عن نقص التروية. الأسلوب هو أداة جديدة للتحقيق في رد فعل الدماغ إلى الإصابة الدماغية.
Introduction
السكتة الدماغية يؤدي الى تغييرات عميقة في نسيج الدماغ المتضررة. فإنه يبدأ موت الخلايا الضخمة، الأمر الذي يؤدي إلى تنشيط الخلايا البلعمية السريع للسكان من أصل دبقية. فإنه يضع أيضا قبالة تسلل الدماغ الدماغية عن طريق أنواع مختلفة من البالعات المهنية المشتقة من الدم بما في ذلك العدلات، الضامة، الجذعية، والخلايا البدينة 1،2.
لا تزال تناقش ما إذا كان هذا ردا على الإصابة الدماغية تلعب دورا إيجابيا أو سلبيا. على الرغم من أن البلعمة التالية السكتة الدماغية يمكن أن تكون مفيدة لأنه يزيل الخلايا الميتة ويقمع التهاب، كما أنها تولد أنواع الاكسجين التفاعلية السامة التي تؤثر على بقاء الخلايا العصبية وتفاقم تلف الأنسجة 1-5.
بينما عدة أنواع من الخلايا البلعمية التسلل الدماغ الدماغية، وليس كل منهم المشاركة في إدارة النفايات التي تجتاح الجثث الخلية ويمهد الطريق لعمليات التجدد 1-3. هذا كرeates شرطا لتحديد الانتقائي للخلايا لإدارة النفايات التي تقوم التخليص أكلة من موت الخلايا في المخ. عند التصوير مثل هذه الخلايا النشطة لإدارة النفايات، من المهم أيضا للرد على مسألة مدى كفاءة أنها تتحلل الجثث خلية غارقة. تدهور فعالة وكاملة من الحمض النووي للخلية الموت في البلعمة أمر ضروري لأنه يمنع التحصين الذاتي والإفراج عن المواد النووية المرضية 6.
هنا نقدم تحقيقات جديدة أن استخدام فواصل الحمض النووي محددة كعلامات الخلايا البلعمية نشطة. ويتم إنتاج هذه فواصل التوقيع حصرا أثناء انهيار نوى اجتاحت داخل الخلايا إدارة النفايات وظيفية. لذا تحقيقات تسمية انتقائي فقط تلك التي تبتلع البالعات وهضم بنشاط الجثث الخلوية. كما أنها تسمح بمراقبة كثافة والانتهاء من انهيار الحمض النووي بعد الابتلاع. تحقيقات مفيدة في تقييم شدة وefficiency التخليص البلعمية.
تحقيقات جديدة تعتمد على علامة غير القائمة على البروتين، وبالتالي يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص في دراسات السكتة الدماغية، حيث يمكن للأضرار واسعة النطاق الدماغية تعطيل مورفولوجيا الخلوية أو تستنفد علامات القائم على البروتين، وخصوصا داخل المنطقة الدماغية الأساسية.
ويرد مبدأ هذه التقنية في الشكل 1. ويوضح الشكل تحقيقات نيوكليوتيدات دقيقة على شكل دبوس ligated قبل topoisomerase انزيم اللقاحية (VACC TOPO) ل5'OH الحمض النووي ينتهي إنشاؤها بواسطة الليزوزومية الدناز الثاني خلال الحمض النووي الهضم 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا الفيديو علينا أن نظهر في شكل قسم الأنسجة، وكيفية تسمية البالعات النشطة التي موت الخلايا واضحة في التنسيق نقص تروية الدماغ. تقنية قدم هو النهج الأول التي تصف على وجه التحديد فقط تلك الخلايا إدارة النفايات التي اجتاحت وهضم بنشاط الجثث الخلوية. وهذا يجعل من المفي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل منحة R01NS062842 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي)، ومنح R21 NS064403 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال الأذربيجانية (الليبرالي) وR21 المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية EB006301 والهندسة الحيوية، والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
