Bedöma fagocyterande Avslut av celldöd i experimentell stroke genom ligerbara fluorescerande prober
Summary
Vi presenterar en ny fluorescensteknik för selektiv in situ märkning av aktiva fagocytiska celler, vilket framgår av cell lik i stroke. Tillvägagångssättet är viktig för att bedöma hjärnans reaktion på ischemi, eftersom endast en liten del av fagocyter som finns i ischemisk hjärnan deltar i clearance av celldöd.
Abstract
Vi beskriver en ny histokemiskt metod för visualisering av fagocytiska clearance i fokal hjärnischemi. Ansatsen möjliggör studier av eliminering av döda celler i stroke med avfallshantering fagocyter av alla cellulära härstamning. Trots att många celler av olika ursprung som har förmåga att fagocytos är närvarande i ischemisk hjärna, endast en del av dem aktivt uppsluka och smälta cell lik. Den selektiva visualisering, kvantifiering och analys av sådan aktiv fagocytos avfallshantering är till hjälp för att bedöma hjärnans reaktion på ischemi. Effektiv celldöd clearance är viktigt för hjärnans återhämtning från ischemisk skada, eftersom det öppnar vägen för de efterföljande regenerativa processer. Misslyckandet med att rengöra liken skulle resultera i en toxisk reaktion som orsakas av icke-nedbrutet DNA och proteiner. Det beskrivna förfarandet använder fluorescerande prober selektivt ligerade av en viral topoisomeras till karakteristiska DNA-brott som produceras i alla fagocyter under omvälvningoch nedbrytning av celler oåterkalleligt skadas av ischemi. Metoden är ett nytt verktyg för att undersöka hjärnans reaktion på ischemisk skada.
Introduction
Ischemisk stroke inducerar djupgående förändringar i den drabbade hjärnvävnaden. Den initierar massiv celldöd, vilket leder till en snabb aktivering av inhemska fagocytiska celler av microglial ursprung. Den sätter också av infiltration av ischemisk hjärna genom olika typer av blodbaserade professionella fagocyter inklusive neutrofiler, makrofager, dendritiska, och mastceller 1,2.
Det är fortfarande debatteras huruvida detta svar på ischemisk skada spelar en positiv eller en negativ roll. Även fagocytos efter stroke kan vara fördelaktigt eftersom det rensar döda celler och dämpar inflammation, genererar det också giftiga reaktiva syreradikaler som påverkar neuronal överlevnad och förvärra vävnadsskada 1-5.
Medan flera typer av fagocyterande celler infiltrerar ischemisk hjärna, inte alla av dem deltar i avfallshantering genom att uppsluka cell lik och banar väg för regenerativa processer 1-3. Denna creates ett krav för selektiv identifiering av avfallshantering celler som utför fagocytiska clearance av celldöd i stroke. När avbildning sådana aktiva avfallshanterings celler, är det också viktigt att svara på frågan om hur effektivt de försämra de uppslukade cell lik. Den effektiva och fullständig nedbrytning av den döende cellens DNA i fagocytos är viktigt eftersom det förhindrar själv immunisering och frisläppandet av patologisk kärnmaterial 6.
Här presenterar vi nya sonder som använder specifika DNA-brott som markörer av aktiva fagocytceller. Dessa signatur raster uteslutande produceras under nedbrytning av uppslukade kärnor inuti funktionella avfallshantering celler. Därför sonderna selektivt märka endast de fagocyter som uppsluka och aktivt smälta cellulära lik. De tillåter också observera intensiteten och slutförandet av DNA-uppdelning efter omvälvning. Sonderna är användbara i utvärdering av intensiteten och efency av fagocytisk rensning.
De nya prober förlita sig på en icke-proteinbaserad markör och kan därför vara särskilt fördelaktig i studier av stroke, där omfattande ischemisk skada kan störa cellulär morfologi eller utarma proteinmarkörer, speciellt inuti kärnan ischemiska zonen.
Principen för tekniken presenteras i Figur 1. Figuren visar hårnålsformad oligonukleotidsonder ligerade genom enzymet vaccinia topoisomeras (VACC TOPO) till 5'OH DNA-ändar som genereras av lysosomal DNas II under DNA-digerering 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här videon visar vi, i vävnaden avsnittet format, hur man märka aktiva fagocyter som tydligt celldöd i fokal hjärnischemi. Den presenterade tekniken är den första metoden som specifikt märker bara de avfallshanterings celler som uppslukade och aktivt smälta cellulära lik. Detta gör det fördelaktigt med hänsyn till andra befintliga metoder för märkning av fagocyterande celler, som inte har denna förmåga.
Metoden använder en generell och selektiv DNA-baserade markör av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av bidrag R01NS062842 från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, National Institutes of Health (VVD) och genom bidrag R21 NS064403 från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, National Institutes of Health genom Arra (VVD) och R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
