Summary
हम सक्रिय phagocytic कोशिकाओं की सीटू लेबलिंग में चयनात्मक के लिए एक नया प्रतिदीप्ति तकनीक मौजूद है, जो स्पष्ट स्ट्रोक में सेल लाशों बंद. इस्कीमिक मस्तिष्क में मौजूद फ़ैगोसाइट के केवल एक छोटे से अनुपात कोशिका मृत्यु की निकासी में भाग लेने क्योंकि दृष्टिकोण ischemia के मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
Abstract
हम फोकल मस्तिष्क ischemia में phagocytic निकासी के दृश्य के लिए एक नया histochemical दृष्टिकोण का वर्णन. दृष्टिकोण किसी भी सेलुलर वंश का अपशिष्ट प्रबंधन फ़ैगोसाइट द्वारा स्ट्रोक में मृत कोशिकाओं के उन्मूलन का अध्ययन परमिट. Phagocytosis में सक्षम हैं कि अलग मूल के कई कक्षों इस्कीमिक मस्तिष्क में मौजूद हैं, उनमें से केवल हिस्सा सक्रिय रूप से अपनी चपेट में ले और सेल लाशों को पचाने. चुनिंदा दृश्य, मात्रा का ठहराव और इस तरह सक्रिय phagocytic अपशिष्ट प्रबंधन के विश्लेषण ischemia के मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का आकलन करने में सहायक होते हैं. यह बाद में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के लिए रास्ता खुल जाता है के रूप में कुशल कोशिका मृत्यु निकासी, इस्कीमिक चोट से मस्तिष्क वसूली के लिए महत्वपूर्ण है. लाशों को साफ करने के लिए विफलता गैर अपमानित डीएनए और प्रोटीन की वजह से एक जहरीले प्रतिक्रिया नतीजा होगा. वर्णित प्रक्रिया चुनिंदा घिराव के दौरान सभी फ़ैगोसाइट में उत्पादित विशेषता डीएनए टूट के लिए एक वायरल topoisomerase द्वारा ligated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता हैऔर कोशिकाओं की पाचन अचल ischemia से क्षतिग्रस्त. विधि इस्कीमिक चोट करने के लिए मस्तिष्क की प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक नया उपकरण है.
Introduction
इस्कीमिक स्ट्रोक प्रभावित मस्तिष्क के ऊतकों में गहरा परिवर्तन लाती है. यह microglial मूल के निवासी phagocytic कोशिकाओं का तेजी से सक्रियण की ओर जाता है, जो बड़े पैमाने पर सेल मृत्यु शुरू. यह भी neutrophils, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान है, और मस्तूल कोशिकाओं 1,2 सहित रक्त प्राप्त पेशेवर फ़ैगोसाइट के विभिन्न प्रकार से इस्कीमिक मस्तिष्क की घुसपैठ बंद सेट.
यह अभी भी इस्कीमिक चोट करने के लिए इस प्रतिक्रिया एक सकारात्मक या नकारात्मक भूमिका निभाता है बहस हो रही है. यह मृत कोशिकाओं को साफ करता है और सूजन को दबा क्योंकि स्ट्रोक के बाद phagocytosis फायदेमंद हो सकता है, यह भी neuronal अस्तित्व को प्रभावित करने और ऊतकों को नुकसान 1-5 exacerbating विषाक्त प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करता है.
Phagocytic कोशिकाओं के कई प्रकार के इस्कीमिक मस्तिष्क में घुसपैठ करते हैं, उन सभी को नहीं सेल लाशों छा और पुनर्योजी प्रक्रियाओं 1-3 के लिए रास्ता साफ़ करके अपशिष्ट प्रबंधन में भाग लेते हैं. यह करोड़स्ट्रोक में कोशिका मृत्यु का phagocytic निकासी के लिए बाहर ले कि अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के चुनिंदा पहचान के लिए एक आवश्यकता eates. ऐसे सक्रिय अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं जब इमेजिंग, यह वे घिरा सेल लाशों नीचा कैसे कुशलतापूर्वक के सवाल का जवाब देना भी जरूरी है. यह आत्म - प्रतिरक्षण और रोग परमाणु सामग्री 6 की रिहाई से बचाता है क्योंकि phagocytosis में मरने कोशिका के डीएनए की प्रभावी और पूरा गिरावट आवश्यक है.
यहाँ हम सक्रिय phagocytic कोशिकाओं के मार्कर के रूप में विशिष्ट डीएनए टूट का उपयोग करने वाले नए जांच उपस्थित थे. ये हस्ताक्षर टूट जाता है विशेष रूप से कार्यात्मक अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के अंदर घिरा नाभिक के टूटने के दौरान उत्पादन किया जाता है. इसलिए जांच चुनिंदा चपेट में ले कि केवल उन फ़ैगोसाइट लेबल और सक्रिय सेलुलर लाशों को पचाने. उन्होंने यह भी घिराव के बाद तीव्रता और डीएनए टूटने के पूरा होने के अवलोकन की अनुमति. जांच तीव्रता और effici के मूल्यांकन में सहायक होते हैंphagocytic निकासी की ency.
नई जांच एक गैर प्रोटीन आधारित मार्कर पर भरोसा करते हैं और इसलिए व्यापक इस्कीमिक क्षति सेलुलर आकारिकी बाधित या विशेष रूप से कोर इस्कीमिक क्षेत्र के अंदर, प्रोटीन आधारित मार्करों खलाना कर सकते हैं जहां स्ट्रोक, के अध्ययन में विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है.
तकनीक के सिद्धांत चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. चित्रा एंजाइम चेचक topoisomerase (Vacc TOPO) द्वारा ligated बाल के लिये कांटा के आकार oligonucleotide जांच से पता चलता है 5'OH डीएनए को पाचन के दौरान 7 lysosomal DNase द्वितीय द्वारा उत्पन्न होता है.
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Protocol
विधि formaldehyde-तय, आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों के लिए उपयुक्त है. तकनीक चूहे में प्रयोगात्मक स्ट्रोक को यहाँ अपने आवेदन में प्रदर्शन किया है.
Tyramide संकेत प्रवर्धन (टीएसए) प्रणाली के लिए 1. तैयारी अवयव
टीएसए आधारित वृद्धि इस प्रतिक्रिया के लिए तैयारी, लेबलिंग के अंतिम चरण में प्रयोग किया जाता है और अधिक से अधिक 1 घंटा लग सकता है. इसलिए यह लेबलिंग शुरू करने से पहले टीएसए अभिकर्मकों बनाने के लिए सुविधाजनक है.
- फ्लोरोफोरे Tyramide शेयर समाधान करें. टीएसए लेबलिंग किट के साथ व्यक्तिगत शीशियों में आपूर्ति की fluorophore Tyramide अभिकर्मक का प्रयोग करें. Tyramide अभिकर्मक शीशी 300 μl DMSO जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब Fluorophore Tyramide शेयर समाधान कम से कम 3 महीने के लिए स्थिर है
- जिसमें टीएनटी धोने बफर बनाओ: 0.1 एम Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच; 0.15 एम NaCl; 0.05% बीच 20. जरूरत 0.3% ट्राइटन X-100 0.05% बीच 20 से बदले जा सकते हैं. Alternatively पीबीएस धोने बफर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- बनाओ TNB युक्त बफर अवरुद्ध: 0.1 एम Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच; 0.15 एम NaCl; 0.5% अवरुद्ध अभिकर्मक (किट के साथ आपूर्ति). क्रियाशीलता, जबकि पूरी तरह से अवरुद्ध अभिकर्मक भंग करने के लिए, धीरे धीरे बफर करने के लिए छोटे वेतन वृद्धि में जोड़ें. धीरे - धीरे निरंतर सरगर्मी के साथ 55 डिग्री सेल्सियस के लिए इस समाधान हीट. यह 30-60 मिनट लग सकते हैं. समाधान दूधिया दिखाई देगा. उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को लाने. लंबी अवधि के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान.
धारा 2. तैयारी
Formalin-तय ऊतकों से कटौती घुड़सवार 5 माइक्रोन मोटी वर्गों के साथ स्लाइड्स का प्रयोग करें.
- 15 मिनट के लिए xylene के साथ वर्गों समझो.
- इस प्रकार के रूप वर्गों rehydrate: 5 मिनट प्रत्येक के लिए 96% EtOH 2x में लेना; 5 मिनट के लिए 80% EtOH में लेना; 5 मिनट प्रत्येक के लिए पानी 2x से धो लें.
- पीबीएस में 50 माइक्रोग्राम / एमएल proteinase कश्मीर शेयर समाधान गिराए द्वारा proteinase कश्मीर में काम कर समाधान करें.
- Proteinase जोड़ेंकश्मीर वर्गों का हल काम कर रहे. 23 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट सेते समाधान की मात्रा और पाचन के समय वर्गों और ऊतक प्रकार के आकार के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. एक छोटे (व्यास में 5 मिमी नीचे) अनुभाग के लिए Proteinase समाधान के 50 μl पर्याप्त होगा. एक औसत आकार के लिए (~ व्यास में 10 मिमी) अनुभाग, proteinase कश्मीर समाधान के 100 μl जोड़ें. बहुत बड़े वर्गों के लिए समाधान की मात्रा को बढ़ाया जा सकता है. सभी मामलों में संकेत के नुकसान को पूरा करने की ओर जाता है और ऊतक आकारिकी नष्ट कर देता है जो वर्गों के overdigestion को रोकने के लिए ध्यान रखना. ऊष्मायन समय 25 मिनट से अधिक है, तो यह अक्सर होता है.
- 5 मिनट प्रत्येक के लिए आसुत जल 2x में वर्गों धो लें. वर्गों पानी में हैं, जबकि सक्रिय जांच युक्त लेबलिंग मिश्रण तैयार करें.
3. Vacc TOPO आधारित धुंधला
- निम्नलिखित संयोजन से सक्रिय जांच समाधान तैयार:
पानी - 11.75 μl
1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 7.4-1.25 μएल
12 बेस अधिकता आत्महत्या oligonucleotide की 100 pmol - 1 μl
एडाप्टर oligonucleotide की 100 pmol - 1 μl
50 pmol Vacc TOPO - 10 μl - Pipetting द्वारा धीरे मिलाएं. जांच के सक्रियण के लिए अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं.
- धोने जार से वर्गों लो और शेष पानी aspirate. फिर 3.1 कदम (~ 10 x 10 मिमी अनुभाग प्रति 25 μl) में तैयार की गई सक्रिय जांच समाधान लागू होते हैं.
- वर्गों coverslip और 23 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते डुबकी धीरे coverslips निकालने के लिए पानी में स्लाइड. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पानी 3x में धो लें.
4. टीएसए बढ़ाने के संकेत
- TNB पहले तैयार और कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए एक humidified कक्ष में स्लाइड्स सेते अवरुद्ध बफर के साथ ऊतक वर्गों को कवर किया.
- TNB अवरुद्ध बफर में streptavidin-हॉर्सरैडिश peroxidase conjugates (एसए एचआरपी) के एक 1:100 कमजोर पड़ने को तैयार है. महाप्राण TNBएसए एचआरपी समाधान बफर और लागू अवरुद्ध. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एसए एचआरपी साथ स्लाइड्स सेते हैं. ऊतक अनुभाग, अनुभाग प्रति आम तौर पर 100 μl कवर करने के लिए पर्याप्त अभिकर्मक मात्रा का प्रयोग करें.
- धो कमरे के तापमान पर टीएनटी धोने बफर (या पीबीएस) में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x स्लाइड.
- किट से 1x प्रवर्धन मंदक में फ्लोरोफोरे Tyramide शेयर का एक 1:50 कमजोर पड़ने को तैयार है. प्रत्येक स्लाइड पर फ्लोरोफोरे Tyramide काम कर समाधान पिपेट. पूरी तरह से ऊतक अनुभाग, अनुभाग प्रति आम तौर पर 100 μl कवर करने के लिए पर्याप्त काम कर समाधान का प्रयोग करें. तुरंत प्रत्येक लेबलिंग से पहले फ्लोरोफोरे Tyramide काम कर समाधान करें. समाधान पुन: उपयोग किया, ताकि लेबलिंग के बाद यह किसी भी अप्रयुक्त भाग त्यागने नहीं किया जा सकता.
- 3 से 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स सेते हैं. संरचनाओं का पहला संकेत देखा जा सकता है जब तक खुर्दबीन के नीचे प्रतिदीप्ति वृद्धि मॉनिटर. जल्दी से कदम धोने के लिए आगे बढ़ें.
- वॉश रूम टी में टीएनटी धोने बफर (या पीबीएस) में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x स्लाइडआंदोलन के साथ emperature.
- DAPI और coverslip के साथ antifading समाधान जोड़ें. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण करें. DAPI और FITC प्रतिदीप्ति एक बैंड पास फिल्टर सेट का उपयोग करने के लिए कल्पना:
FITC उत्तेजना D490/40, उत्सर्जन 520/10; DAPI उत्तेजना D360/40, उत्सर्जन 460/20, या इसी तरह की.
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Representative Results
सक्रिय अपशिष्ट प्रबंधन फ़ैगोसाइट लेबलिंग के लिए तकनीक का सिद्धांत चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. योजनाबद्ध दर्शाता तीन चरणों में पता लगाने आगम कि. पहले कदम के जांच सक्रियण (चित्रा 1 ए) शामिल हैं; दूसरे चरण में सक्रिय जांच ऊतक वर्गों (चित्रा 1C) में विशिष्ट डीएनए टूट करने के लिए ligated है; तीसरे चरण फ्लोरोसेंट संकेत प्रवर्धन (चित्रा -1) शामिल हैं. इस प्रकार के रूप में एक अधिक विस्तृत विवरण में पता लगाने के लिए चला जाता है:
1. जांच सक्रियण. पिछले बंधाव प्रतिक्रिया के लिए Vacc TOPO oligoprobe के 3 'अंत करने के लिए covalently जुड़े होने की जरूरत है. जांच के सक्रियण के दौरान Vacc TOPO बाल के लिये कांटा एडाप्टर डुप्लेक्स और cleaves ऊपरी किनारा करने के लिए देता. 12 आधार लंबा हिस्सा तो स्थायी रूप से बाल के लिये कांटा के 3 'अंत में संलग्न Vacc TOPO छोड़ने, अलग करती है. इसके 3 'के अंत से जुड़ा हुआ एंजाइम के साथ इस oligonucleotide DNase द्वितीय प्रकार विराम (चित्रा 1 बी) लेबल कर सकते हैं. एंजाइम एक छोटा किनारा 8 कटौती नहीं होगी और इसलिए जांच के लिए देते हैं और उसके 3 'अंत सक्रिय करने में असमर्थ हो जाएगा क्योंकि 12 आधार अधिकता और एक एडाप्टर oligo आवश्यक हैं.
2. जांच बंधाव. Biotinylated hairpins मृत कोशिकाओं के नाभिक को पचाने फ़ैगोसाइट द्वारा उत्पन्न कुंद एंडेड डीएनए टूट 5'OH को Vacc TOPO द्वारा ligated कर रहे हैं. जुड़ा जांच Tyramide वृद्धि 9 का उपयोग कर प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं.
3. फ्लोरोसेंट संकेत दे Tyramide संकेत प्रवर्धन (टीएसए) 9 प्रणाली का उपयोग करके हासिल की है. इस प्रक्रिया के दौरान streptavidin-हॉर्सरैडिश peroxidase conjugates biotinylated hairpins के लिए देते हैं और दृढ़ता से फ्लोरोसेंट साइटों का निर्माण, पास के इलाके में फ्लोरोसेंट tyramides के बंधन को सक्रिय करें.
प्रयोगात्मक स्ट्रोक के लिए तकनीक का e_content "> आवेदन चित्रा 2 में दिखाया गया है. स्थायी फोकल मस्तिष्क ischemia के शुरू होने के बाद चूहे के मस्तिष्क के 48 घंटे में कोशिका मृत्यु समाशोधन सक्रिय phagocytic कोशिकाओं के 2 प्रस्तुत प्रतिदीप्ति छवियों चित्रा. कोशिकाओं Vacc TOPO द्वारा चिह्नित कर रहे हैं वर्णित जांच के रूप में. जांच सक्रिय रूप से अपनी चपेट में ले और सेल लाशों 7 पचाने जो फ़ैगोसाइट अंकन, DNase द्वितीय विराम (हरी प्रतिदीप्ति) के साथ विशाल phagolysosomes 10 कल्पना. DAPI के साथ एक साथ सह धुंधला फ़ैगोसाइट की और फ़ैगोसाइट अंदर चपेट में कोशिकाओं के chromatin लेबल. Vacc TOPO और DAPI संकेतों के ओवरले आसान पहचान और सक्रिय phagocytic कोशिकाओं की रूपात्मक विश्लेषण की अनुमति. साफ प्रस्तुति के लिए, चित्र दिखाया घटनाओं के चित्र से पूरित कर रहे हैं.तस्वीरें "चौड़ाई =" 500 "/>
विधि का सिद्धांत:. Ligatable जांच से मस्तिष्क वर्गों में phagocytic निकासी की 1 जांच चित्रा.
चित्रा 2 ischemia के शुरू होने के बाद प्रायोगिक स्ट्रोक 48 घंटा:. कोशिका मृत्यु का phagocytic निकासी phagocytic निकासी के दो उदाहरण.. Ligatable Vacc TOPO जांच - हरी प्रतिदीप्ति. परमाणु दाग DAPI - नीली प्रतिदीप्ति. छवियों में प्रस्तुत घटनाक्रम (सही कॉलम) के चित्र फ़ैगोसाइट और pycnotic के नाभिक पाचन के विभिन्न चरणों में अतिरिक्त नाभिक घिरा हुआ दिखा. स्केल बार - 15 माइक्रोन.
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Discussion
इस वीडियो में हम फोकल मस्तिष्क ischemia में जो स्पष्ट कोशिका मृत्यु सक्रिय फ़ैगोसाइट लेबल करने के लिए कैसे, ऊतक अनुभाग प्रारूप में, प्रदर्शित करता है. प्रस्तुत तकनीक विशेष रूप से घिरा हुआ है और सक्रिय सेलुलर लाशों को पचाने में है, जो केवल उन अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं लेबल जो पहले दृष्टिकोण है. यह इस क्षमता नहीं है जो phagocytic कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए अन्य मौजूदा तरीकों के संबंध में यह फायदेमंद बनाता है.
, डबल असहाय घिरा नाभिक के पाचन के दौरान अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं की phagolysosomes में उत्पादन को समाप्त 5'OH डीएनए टूट कुंद - विधि phagocytic गतिविधि का एक सामान्य और चयनात्मक डीएनए आधारित मार्कर का उपयोग करता है. केवल सक्रिय phagocytic कोशिकाओं के इस विशेष लेबलिंग तीव्रता और इस्कीमिक मस्तिष्क में phagocytic प्रतिक्रिया की दक्षता का सटीक आकलन परमिट.
तकनीक मजबूत है और वर्णित के रूप में सभी चरणों का पालन कर रहे हैं अच्छी तरह से काम करता है. proteinase कश्मीर digestiकदम पर मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धुंधला के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस चरण में Overdigestion अनुभाग से डीएनए के नुकसान की ओर जाता है और कमी या भी संकेत को खत्म हो सकता है. अन्य महत्वपूर्ण बिंदु चेचक topoisomerase एंजाइम का एक अत्यधिक सक्रिय तैयारी का उपयोग करने के लिए है. तकनीक की एक सीमा है कि यह ताजा जमे हुए वर्गों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है.
दृष्टिकोण apoptosis की पढ़ाई करने के लिए व्यापक प्रयोज्यता है और इस्कीमिक मस्तिष्क से परे अन्य ऊतकों और शर्तों को विस्तार योग्य है. विविध भाग लेने वाले अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के साथ अनेक प्रकार की कोशिकाओं से बना अंगों और ऊतकों में phagocytic प्रतिक्रियाओं के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है जब यह विशेष रूप से सुविधाजनक है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस शोध मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान R01NS062842 और स्वास्थ्य (VVD) के स्ट्रोक, राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा और मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और ARRA के माध्यम से स्वास्थ्य के स्ट्रोक, राष्ट्रीय संस्थान (VVD) और R21 से अनुदान R21 NS064403 द्वारा समर्थित किया गया बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग EB006301 राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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