Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter
Summary
This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.
Abstract
The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.
Introduction
Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem verstärkten Interesse im Umgang mit zellulären Mikroarrays in der Arzneimittelforschung für Wirkstoff-Screening und Analyse cytotoxicological 1,2,3 geführt. Die Entwicklung von in-vitro-Assays mit hohem Durchsatz und Screening-Methoden unter Verwendung von Zellmikroarrays würde die schnelle und kostengünstige Entwicklung von Wirkstoffkandidaten sowie Voraus die grundlegenden Verständnis der Zelle 1,4 erleichtern. Der traditionelle Ansatz für Screening mit Zellen verwendet herkömmliche Well-Platte-Plattformen; jedoch ist dieser Ansatz aufgrund der hohen Kosten, begrenzte Durchsatz und begrenzte Fähigkeit zur quantitativen Informationen über Zell-Funktion 1,5 begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen ist die Forschung in der Zell-Microarray-Technologien aufkeimenden für molekularbiologische Charakterisierung, Tissue Engineering und Drug-Screening 1,6. Die Vorteile der zellulären Mikroarrays sind kleinere Proben Nutzung, minimale Effekte vonzellulären Phänotyps Heterogenität Maskierungsinformationen, und vor allem die Fähigkeit, mehr Tests für Anwendungen mit hohem Durchsatz 1,7,8 automatisieren.
Die Pharmaindustrie nutzt derzeit Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays mit 2D-Zellmonolayer-Kulturen für Wirkstoff-Screening in Mikrotitervertiefung Platten 9. Multiplex-Zellen in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten bietet das Potential für höhere Durch mit einzigartigen Experimentiermöglichkeiten. Ferner können die aktuellen Technologien für Mobilmicroarrays um die Zellen zu trocknen, die den Phänotyp der Zellen drastisch verändern können aus in vivo 10,11. Um diese Probleme zu überwinden, die MFCA wurde entwickelt und ist in Fig. 1 gezeigt. Das Design der Fluidik MFCA 3D ermöglicht die Druckkopfspitze in Fig. 1 in ein Bad abgesenkt und gegen die Oberfläche zusammengedrückt, um eine Dichtung zu bilden. Die weiche Silikonspitze des Druckkopfes verhält sich wie einDichtung und einen reversiblen Dichtung bildet. Die MFCA Technologie ist einzigartig geeignet, mit untergetauchten Oberflächen, die für beide Zellkulturen und Gewebeschnitt Systeme erforderlich Schnittstelle, und es ist schwierig oder unmöglich mit den meisten anderen Ansätzen. Pins oder Tintenstrahldruck wird nicht funktionieren, und 2D-Mikrofluid-Geräte sind nicht für die Abscheidung oder Schnittstellen mit großen Arrays von diskreten Stellen geeignet. Ferner werden durch die Miniaturisierung und die Lokalisierung des Experiments – der zellulären Mikroarray – der MFCA windet die große Probleme mit der Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays verbunden.
Die CFM verwendet 3D-Kanal-Netzwerke zu Zyklus kleines Volumen Flüssigkeitsproben über mikroskopische Ort Stellen auf einer Oberfläche 12,13. Durch das Drucken mit Durchfluss sind Biomoleküle, Zellen und anderen Reagenzien in einer flüssigen Umgebung während des gesamten Druckprozesses beibehalten, so dass der Druck von empfindlichen Biomoleküle und Zellen ohne Kontakt mit Luft, die die aktuelle Zelle Drucktechniken behindert. Es ist auch möglich, direkt aus rohem Material, wie Hybridom-Überständen oder sofern ein Erfassungsmechanismus auf der Array-Oberfläche zu drucken. Das Ziel dieser Handschrift ist es, im Detail die untergetauchten Druck von beiden Zelltypen auf eine Oberfläche zu erklären.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene 3D-Mikrofluid-Drucktechnologie ist einzigartig in der Lage, Druck mikrofluidisch Arrays von Zellen in einer Flüssigkeit gut gefüllt, dh ein unter Wasser Oberfläche. Durch Bedrucken untergetauchten Oberflächen können Zellmikroarrays erzeugt werden, die die physiologisch relevanten zellularen Phänotyps von Zellen als auch die Fähigkeit, Zellen in den Boden einer einzelnen Vertiefung 4 multiplexen aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass mikrofluid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Chris Morrow, um technische Unterstützung zu bestätigen. Die Finanzierung wurde durch die NIH SBIR (R43) zu gewähren 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Continuous Flow Microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | cell media additive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | stain cell sfor counting |
| Haemocytometer | Fisher | 267110 | cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | used to remove cells from surface |
References
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. . Integrated Biochips for DNA Analysis. , (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
