Последовательный<em> В естественных условиях</em> Визуализация остеогенные стволовых / клеток-предшественников во время разрушения Ремонт
Summary
Количественное измерение функции костного предшественников в лечении переломов требуется технологию серийного изображений с высоким разрешением. Здесь, протоколы предназначены для использования прижизненной микроскопии и отслеживание костно-клонов, чтобы последовательно изображение и количественной оценки миграции, пролиферации и дифференцировки остеогенных эндогенных стволовых клеток / клеток-предшественников в процессе ремонта переломов костей.
Abstract
Кость переворачивается непрерывно и настоятельно регенеративная следующие травмы. Остеогенные стволовых клеток / предшественников уже давно предположили существование, но в естественных условиях демонстрации таких клеток только недавно были достигнуты. Здесь естественных условиях методы визуализации в исследовать роль эндогенных остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников (OSPCs) и их потомство в ремонте костной предоставляются. Использование костно-клонов клетки трассировки модели и прижизненной визуализации индуцированных микротрещин в свода черепа кости, OSPCs можно непосредственно наблюдать в течение первых нескольких дней после травмы, в которых критические события в начале процесса восстановления произойти. Сайты Травмы могут быть последовательно отображены показывая, что OSPCs переехать в травме, увеличение числа и дифференцируются в остеобласты костных формирования. Эти методы предлагают средства исследования роли стволовых клеток внутренних и внешних регуляторов молекулярной для регенерации и восстановления костей.
Introduction
Дегенеративные заболевания костей и возрастная потеря костной приводит к высокому риску остеопороза переломов стала одной из основных проблем в области общественного здравоохранения 1. Обслуживание Кость контролируется, формирующие костную остеобластов и костных резорбции остеокластов. Дефекты клеток костного формирования являются основной причиной возрастной потери костной ткани и дегенеративных заболеваний костей 2,3. В то время как обширные исследования были направлены на улучшение заживления переломов, открытие надежных препаратов для лечения дегенеративных заболеваний костей и переломить слабость переломов остается важным вопросом. Таким образом, изучение источник клеток костного формирования и их механизмов контроля в регенерации и восстановления костей обеспечивает новый представление для повышения скелетных регенерацию и обратить вспять заболеваниями потери костной массы.
Существование мультипотентными мезенхимальных клеток в костном мозге была предложена на основании идентификации клоногенных населения, которые могли бы иначеИАТЭ в остеогенные, Adipogenic и хондрогенные клоны экс естественных 4. Недавно несколько исследования показали, что скелетные / мезенхимальные стволовые клетки (КСЭ / МСК) являются естественным источником остеобластов и имеют решающее значение для костной ткани, реконструкции и ремонта трещин 5,6 . Кроме того, наша линия трассировки исследование показало, что зрелые остеобласты имеют неожиданно короткий период полураспада (~ 60 дней) и постоянно пополняется за счет их стволовых клеток / клеток-предшественников как в нормальных гомеостатических и ремонт перелом условиях 6. Тем не менее, личность в естественных условиях из стволовых клеток и как такие клетки реагируют на перелом травмы и поставить клетки костного формирования неясны. Таким образом, важно разработать метод, который способен анализировать миграции, пролиферации и дифференцировки эндогенных SSCS / МСК в в физиологических условиях.
Перелом ремонт многоклеточным и динамичный процесс регулируется массив комплексацитокины и факторы роста 7. Самый популярный подход для изучения разрушения является использование животную модель с переломом долгосрочной кости и проанализировать кости, кости срезов и методов иммунофлуоресцентных 8-10. Этот процесс ремонта можно контролировать с помощью нескольких методов визуализации в том числе микро-КТ 11, ближней инфракрасной флуоресценции 12 и ХЛ изображений 13. Однако каждый метод имеет определенные ограничения и не было эффективного способа контролировать функцию КСЭ / MSC на клеточном уровне в естественных условиях. Недавно конфокальной / двухфотонного прижизненной микроскопии был разработан и используется для обнаружения трансплантированных раковых клеток и гемопоэтических стволовых клеток в контексте их микросреды костного мозга даже при разрешении одноклеточного в живых животных 14. Объединив эту технологию с серией моделей трассировки линии преемственности, мы смогли определить, что клетки остеогенной стволовых / предшественники могут быть генетически отмечен переходного переменного токативации сопротивления myxovirus -1 (Mx1) промоутер и MX1-индуцированной предшественников может поддерживать большинство зрелых остеобластов в течение долгого времени, но не участвуют в генерации хондроцитов у взрослых мышей 6. Кроме того, мы показали, что Mx1 меченные OSPCs поставлять большинство новых остеобластов в трещины исцеления 6.
Здесь, используя модели отслеживания костно-происхождение и прижизненный микроскопии, протокол обеспечивается определить Vivo кинетики в из MX1 + остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников в репарации переломов. Этот протокол предлагает последовательный воображение для того чтобы отслеживать перемещение остеогенных шток / предшественников в сайтах разрушения и количественное измерение расширения osteoprogenitor в начале процесса восстановления. Этот подход может быть полезен в нескольких контекстах, включая оценки терапевтических кандидатов для улучшения восстановления костей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Регулирование скелетных стволовых клеток может иметь большое значение для определения более совершенных методов для достижения регенерации кости. Количественный и порядковый изображений на клеточном уровне была технически сложной задачей. Хотя модель перелом длинных костей мыши ш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим С. парк за чтение рукописи. Эта работа была поддержана NIAMS под Award Количество K01AR061434 и лейкемии и лимфомы общества стипендий премии (5127-09) в DP и гранты Национальных Институтов Здоровья в CPL и DTS Содержание несут их авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здравоохранения.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
- Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
- Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
- O’Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
- Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
- Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
