Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

Summary

Développer des protéines de fusion biotinylatable a de nombreuses applications potentielles dans différents domaines de recherche. Recombinant ingénierie des protéines est une procédure avant droite qui est rentable, offrant des rendements élevés de protéines sur mesure.

Abstract

Recombinant ingénierie des protéines a utilisé Escherichia coli (E. coli) systèmes d'expression pour près de 4 décennies, et aujourd'hui E. coli est toujours l'organisme d'accueil le plus largement utilisé. La flexibilité du système permet l'ajout de groupements tels que une étiquette de biotine (pour les interactions de streptavidine) et des protéines fonctionnelles plus grands comme protéine fluorescente verte ou cerise protéine rouge. De plus, l'intégration des acides aminés non naturels tels que des chélateurs d'ions métalliques, les groupes fonctionnels réactifs de manière unique, des sondes spectroscopiques, et des molécules conférant des modifications post-traductionnelles a permis une meilleure manipulation des propriétés de protéines et de fonctionnalités. En conséquence, cette technique crée des protéines de fusion personnalisables qui offrent une grande utilité pour les différents domaines de recherche. Plus spécifiquement, la séquence de la protéine biotinylatable a été incorporé dans de nombreuses protéines cibles en raison de l'interaction de haute affinité entre la biotine avec l'avidine et la streptavidine. Cet ajout a aidé à améliorer la détection et la purification de protéines marquées ainsi que l'ouverture de la voie à des applications secondaires telles que le tri de cellules. Ainsi, les molécules de biotine montrent une influence croissante et généralisée dans les domaines bio-industrielles et biomédicales. Aux fins de notre recherche, nous avons conçu des protéines de fusion recombinantes biotinylé contenant le facteur de croissance des nerfs (NGF) et semaphorin3A (Sema3A) régions fonctionnelles. Nous avons indiqué précédemment comment ces protéines de fusion biotinylée, avec d'autres séquences de protéines actives, peuvent être attachés à des biomatériaux pour l'ingénierie des tissus et à des fins de régénération. Ce protocole définit les principes de base de protéines de biotinylatable d'ingénierie à l'échelle du milligramme, en utilisant un lac vecteur inductible T7 et E. hôtes d'expression coli, à partir de la transformation à l'échelle et la purification.

Introduction

Protéines couvrent une large gamme de biomolécules qui sont responsables de nombreuses fonctions biologiques, conduisant finalement à la formation de tissu propre et de l'organisation. Ces molécules lancer des milliers de voies qui contrôlent la régulation et / ou la régulation de gènes et d'autres protéines de signalisation, maintien de l'équilibre dans le corps humain. Perturbation d'une seule protéine affecte l'ensemble de ce réseau de signaux, ce qui peut conduire à l'apparition de troubles ou de maladies dévastatrices. Ingénierie des protéines individuelles dans le laboratoire propose une solution pour lutter contre ces effets indésirables et offre une alternative aux médicaments à petites molécules. En 1977, un gène codant pour la séquence de la somatostatine 14 d'acides aminés a été l'un des premiers polypeptides modifiés créés à l'aide de E. coli ^1. Peu de temps après, en 1979, l'insuline a été cloné dans le plasmide pBR322, transformé, a exprimé, et purifié ^2. Depuis lors, des protéines recombinantes ont étendu leur influence à de multiples domaines de resecherche tels que les biomatériaux, l'administration de médicaments, l'ingénierie tissulaire, les produits biopharmaceutiques, de l'agriculture, des enzymes industrielles, les biocarburants, etc (pour avis voir les références ^3-8). Ceci est largement dû à la souplesse que la technique propose via l'addition de l'application des fragments chimiques spécifiques ou des séquences de protéines à des fins, y compris, mais sans s'y limiter, l'identification de la protéine cible, de stabilisation et de purification.

Via la technologie de l'ADN recombinant, des protéines recombinantes peuvent être exprimées dans une variété de systèmes hôtes eucaryotes et procaryotes, notamment de mammifères, de plantes, d'insectes, de levures, de champignons ou de bactéries. Chaque hôte offre des avantages différents et généralement le meilleur système est déterminée sur la base de la fonction des protéines, le rendement, la stabilité, le coût global, et l'évolutivité. Des cellules de bactéries manquent souvent des mécanismes de modifications post-traductionnelles qui fournissent des hôtes eucaryotes (par exemple glycosylation, le disulfure de pontage, e tc.) ^5. En conséquence, les systèmes de mammifères et d'insectes aboutissent généralement à une meilleure compatibilité et l'expression de protéines eucaryotes, mais ces hôtes sont généralement plus coûteux et prend du temps ^9. Par conséquent, E. coli est l'hôte privilégié pour notre système d'expression parce que les cellules se développent rapidement dans des conditions de croissance peu coûteux et les mécanismes d'expression génétique sont bien comprises ^{de 5,9.} En outre, ce système est facile à l'échelle supérieure à des fins de production et les résultats dans les protéines fonctionnelles en dépit de l'absence de modifications post-traductionnelles ^10. Le E. souche de E. coli K12 est choisi dans ce protocole pour le clonage, car cette souche offre d'excellents rendements en plasmide basé sur l'efficacité de transformation élevées. En outre, un E. souche de E. coli BL21 est utilisé pour l'expression, car cette souche hôte contient le gène d'ARN polymerase de T7, qui fournit l'expression des protéines et la stabilité contrôlée ^11.

tente "> Après la sélection de l'hôte, en outre il faut prendre soin dans le choix du vecteur d'expression idéal pour faciliter l'expression de la protéine choisie et contrôlée. synthèse de protéines recombinantes commence par une séquence d'ADN cible qui est clonée sous la direction du bactériophage transcription de T7 et de signaux de traduction, et l'expression est induite dans des cellules hôtes contenant des copies chromosomiques du gène de l'ARN polymerase T7 ^12. Ces vecteurs, dérivés de pBR322 du vecteur plasmidique (pour une revue, voir la référence ^13), sont étroitement contrôlée par le promoteur T7 initialement développée par Studier et al ¹⁴ et de fournir plus d' contrôle grâce à l'inclusion de l'opérateur lac et le répresseur lac (LAC1) ^15,16. Pour l'ingénierie des protéines recombinantes, ce système d'expression offre la possibilité d'adapter une séquence d'acides aminés spécifique d'une protéine souhaitée par l'insertion des séquences d'ADN cibles ou pour créer des protéines de fusion composée de domaine combinéss de protéines simples. En outre, certaines séries de vecteurs comprennent des modifications de points de peptides à être mis sur le N ou C-terminale. Pour nos besoins de conception, une histidine (His) tag a été ajouté à la séquence cible d'ADN pour une purification et une séquence biotinylatable 15 d'acides aminés a été inclus pour la biotinylation ^17,18. Dans ce protocole, un plasmide contenant un gène de résistance à l'ampicilline, a été choisi pour réaliser nos séquences de protéine de fusion biotinylatable. L'expression est contrôlée dans ce vecteur par l'intermédiaire du promoteur lac de T7 et est facilement induite par isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

expressions de test (cultures à petite échelle) sont utilisés pour déterminer la présence et la solubilité de la protéine cible, qui peut être exprimée soit sous forme soluble ou insoluble à formuler des procédures de purification. Une protéine soluble exprimé dans la cellule de bactérie subira pliage spontané de maintenir sa structure native ^19. Typiquement, le natifla structure est thermodynamiquement favorable. Dans de nombreux cas, l'activité métabolique de l'hôte n'est pas propice à la protéine cible, en mettant l'accent sur le système qui conduit à la production de la protéine insoluble et la formation de corps d'inclusion constitués d'agrégats de protéines insolubles. Ainsi, la protéine cible dénature, ce qui les rend généralement biologiquement inactif ^20. Les deux expressions de test sont mis à l'échelle en place, les procédures d'isolement et sont déterminées par la solubilité de la protéine cible. Une renaturation ou étape de repliement supplémentaire est nécessaire pour les protéines insolubles. Les protéines recombinantes résultantes peuvent en outre être purifiés en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille.

Dans la maison de production de protéines recombinantes offre des avantages de coûts par rapport aux produits commerciaux depuis milligrammes de protéine cible peut être isolé par litre de culture principale. La plupart de l'équipement nécessaire est disponible dans un laboratoire biologique ou chimique typique. L'ingénierie des protéines permet la créationde protéines de fusion personnalisé avec des fonctionnalités supplémentaires qui ne sont pas toujours disponibles dans le commerce. Figure 1 illustre les principales procédures liées à des protéines recombinantes de l'ingénierie. Avec ce système d'expression, nous avons créé de nombreuses protéines biotinylatable, telles que l'interféron-gamma, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, et d'os protéine morphogénétique ^21-23, mais nous allons nous concentrer sur deux protéines que nous avons conçu pour le guidage axonal, NGF (29 kDa ) et Sema3A (91 kDa) ¹⁰ (pour revue voir référence ^24). La biotinylation est une technique courante pour l'identification, l'immobilisation et l'isolement des protéines marquées en utilisant la biotine-streptavidine bien connu interaction ^25-27. Sondes biophysiques ^28,29, biocapteurs ^30, et ³¹ points quantiques sont des exemples de systèmes qui utilisent la haute affinité de la conjugaison de biotine-streptavidine avec un _Kd de l'ordre de 10 ^-15 M ^27. Le E. bio coliétain ligase, BirA, aide à la fixation covalente de la biotine à la chaîne latérale de la lysine trouvé à l'intérieur de la séquence étiquetée biotine ^18,32. Tethering biotine à des matériaux et des biomolécules a produit une distribution soutenue des facteurs de croissance à la cellule pour de multiples applications de génie tissulaire ^21,33-35. Par conséquent, l'ingénierie des protéines biotinylatable conçu sur mesure est un outil puissant qui peut transcender les intérêts de recherche multiples.

Protocol

Une. Conception de la protéine cible Utilisation du Centre national pour le site Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtenir une séquence d'acides aminés de la protéine cible en tenant compte des espèces d'intérêt et des variants d'épissage. Sélectionner la séquence d'acides aminés qui correspond à la région active d'intérêt de la protéine. Remarque: Pour Sema3A, acides aminés 21-747 ont été choisis. Une protéine de fusion a été con…

Representative Results

Clonage et expression de test Lorsque le placage est effectué correctement, simples colonies isolées devraient former pour augmenter les chances de plumer clonale transformées cellules bactériennes (figure 2A). Cependant, si trop de cellules sont étalées, les plaques sont incubées trop longtemps à 37 ° C ou transformation est discutable, les colonies peuvent couvrir la plaque de gélose ou former de plus grands agrégats de cellules (f…

Discussion

Recombinant ingénierie des protéines est une technique très puissante qui s'étend sur plusieurs disciplines. Il est rentable, accordable et une procédure relativement simple, ce qui permet la production de rendements élevés de protéines sur mesure. Il est important de noter que la conception et l'expression de protéines cibles n'est pas toujours évident. Expression basale et la stabilité de la protéine recombinante dépendent des choix spécifiques de vecteur, E. coli souches cellulaires…

Materials

1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Acetic acid, glacial	EMD	AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtration standard	Bio-Rad	151-1901	6 vials
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-3	2.5 L
Imidazole	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 pack
Potassium Chloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Sodium phosphate diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
Yeast extract, granulated	EMD	1.03753.0500	500 g
Name of Kits/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Heating Oven FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	OMEGA bio-tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes	VWR	3119-0050	50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Protein Services
Ultrasonic Processor	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560