Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex
Summary
Neural stamfar mitose er en kritisk parameter for neurogenesis. Mye av vår forståelse av neural stamceller mitose er basert på analyse av fast vev. Live-bildebehandling i embryonale hjernen skiver er en allsidig teknikk for å vurdere mitose med høy tidsmessig og romlig oppløsning i et kontrollert miljø.
Abstract
Selv om det av kort varighet, i mitose, og en kompleks dynamisk flertrinnsprosessen fundamental for utvikling av organer, inkludert hjernen. I utviklings hjernebarken, kan unormal mitose av nevrale stamceller føre til defekter i hjernens størrelse og funksjon. Derfor er det et kritisk behov for verktøy til å forstå mekanismene for nevrale stamceller mitose. Hjernebarken hos gnagere er en enestående modell for å studere denne prosessen. Neural stamfar mitose er ofte undersøkt i faste hjerne seksjoner. Denne protokollen vil beskrive i detalj en tilnærming for levende avbildning av mitose i ex vivo embryonale hjernen skiver. Vi vil beskrive de kritiske trinn for denne prosedyren, som inkluderer: hjernen utvinning, hjerne embedding, vibratome seksjonering av hjernen skiver, farging og dyrkning av skiver, og time-lapse bildebehandling. Vi vil da vise og beskrive i detalj hvordan du skal utføre etter overtakelsen analyse av mitose. Vi inkluderer representative resultater frOM denne analysen bruker vital fargestoff Syto11, transgene mus (histone H2B-EGFP og centrin-EGFP), og i utero elektroporering (mCherry-α-tubulin). Vi vil diskutere hvordan denne prosedyren kan være best optimalisert og hvordan det kan bli endret for studie av genetisk regulering av mitose. Sanntids avbildning av mitose i hjerneskiver er en fleksibel tilnærming for å vurdere virkningen av alder, anatomi, og genetisk forstyrrelse i et kontrollert miljø, og for å generere en stor mengde av data med høy tidsmessig og romlig oppløsning. Derfor denne protokollen vil utfylle eksisterende verktøy for analyse av nevrale stamceller mitose.
Introduction
Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive hvordan man skal opptre live avbildning av nevrale stamceller mitose i embryonale hjernen skiver. Ved hjelp av direkte avbildning av hjernen skiver i kultur, gir denne protokollen en enkel metode for å bestemme flere aspekter av mitose i nevrale stamceller i et miljø svært lik en in vivo setting. Det kan brukes på hjernen hos mutante dyr og / eller hjernen som er blitt manipulert med in utero electroporation) 1-5. Denne teknikken er også ideelt for å teste virkningen av farmakologiske midler på nevrale forløpere 'mitose, ved ganske enkelt å legge til en agent til kulturmediet. I sum vil denne artikkelen være en teknisk utfordrende protokoll tilgjengelig for de som studerer neurogenesis.
Under neurogenesis, distinkte nevrale stamceller populasjoner gjennomgå presise divisjoner for å generere nevroner som til slutt bidrar til de seks cortical lag av den voksne neocortex 6-8. Tidlig i hjernebarken, utvider den nevrale forløper bassenget som neuroepithelial (NE) celler deler symmetrisk til selv fornye. NE celler deretter konvertere til radiale gliaceller (RGCs). Utgangspunktet RGCs dele symmetrisk å produsere to nye RGCs, men under mesteparten av neurogenesis, er asymmetrisk RGCs 'viktigste modusen for divisjonen. I asymmetrisk fordeling, gir en RGC opphav til en ny RGC og enten en post-mitotiske neuron, eller en mer spesialisert progenitor (enten en kort neural forløper (SNP), en ytre radial gliaceller (ORG), eller i en mellomliggende progenitor (INP) 2,3,7,9. INPS, SNP'er, og orgs kan deretter generere neuroner på sub-ventrikulær, ventrikulær og basal regioner i cortex, respektivt. Derfor er celledeling stamceller som en grunnleggende prosess for generering av nevronene i neocortex.
Tallrike studier peker på en sammenheng mellom bestemte mitotiske trekk av RGCs og skjebnen til datterceller. Haydar et al. Og Takahashi et al.har vist at RGC mitotisk varighet og cellesykluslengde økning som neurogenesis provenyet, et funn ekko i oppfølging studier 10-13. En rekke studier har antydet at mitotisk spindel orientering i forhold til ventrikkelen påvirker aspekter av neurogenesis og corticogenesis, inkludert typer av nerveceller som genereres og plasseringen av avkom i hjernen, henholdsvis 3,10,14-16. Enten cleavage fly orientering påvirker celle skjebne direkte er kontroversielt, men konklusjonen er fortsatt at dette mitotic parameter virkninger neurogenesis. Videre understreker viktigheten av mitose er den observasjon at mange gener involvert i mekanikken i mitose er avgjørende for neurogenesis og for riktig hjernens utvikling 17-20.
Mitose er en dynamisk prosess, men til dags dato de fleste studier detaljering nevrale stamceller mitose utnytte analyse av faste vevssnitt eller avbildning av nevrale stamceller via in vitro cellekultur. Dermed blir mainstream metoder for å vurdere mitose kun gir et øyeblikksbilde av denne prosessen og ikke klarer å avdekke hvordan cellene oppfører seg i en vev. Live-avbildning av nevrale stamceller mitose har i økende grad blitt et viktig redskap for å forstå nevrale stamceller funksjon. For eksempler se disse referansene 4,8,10,21-25. Flere fremragende protokoller har blitt publisert for forberedelse og avbildning av hjernen skiver 26,27. Men til dags dato, har en omfattende protokoll for bildebehandling og analyse av mitose ikke beskrevet eller vist i videoen.
Denne teknikk byr på flere vesentlige fordeler i forhold til faste analyse av hjerneseksjoner. Time-lapse analyse av hjernen skiver muliggjør generering av vesentlig flere datapunkter som kan analyseres på en fleksibel måte. For det første blir data samlet på enkelte tidspunkter i løpet av flere minutter eller flere timer. Man kan analysere individuelle tidspunkter (for å lage en statisk montasje) ellerkan kombinere ulike tidspunkt i filmer. For det andre, confocal avbildning av skiver muliggjør generering av data på ulike Z seksjoner i hjernen skiver. Som et resultat, kan de enkelte seksjoner analyseres. Alternativt kan stabler av individuelle seksjoner kombineres til en maksimal intensitet projeksjon. Tredje, er analyse gjort i sammenheng med en vev, avslører hvordan celler deler seg i forhold til nabocellene og strukturer. Fjerde, er det ideelt til analyse av mutanter som viser noen tegn til mitotiske defekter. Sammen denne protokollen vil bidra til å avklare viktige skritt for å hjelpe etterforskere som ønsker å gjennomføre direkte avbildning av nevrale stamceller mitose i egne laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den store fordelen med protokollen vi har beskrevet er at det gir en dynamisk temporal oppløsning på mitose av nevrale stamceller. Vanligvis er analyser for å visualisere mitose i utviklingen av hjernen utføres ved hjelp av immunfluorescens av faste vevssnitt. Men denne tilnærmingen gir bare et øyeblikksbilde av mitose på ett tidspunkt.
Det er flere trinn som er mest kritisk for avbilding av mitose i hjernen skiver: 1) De hjernen skiver bør forbli festet til agarose, for å bevare in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner midler fra ninds / NIH, R00-NS064197 og ninds / NIH, R01NS083897 (både til DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
