Summary
Peptid tertiära amider (pesetas) är en superfamilj av peptidomimetika som inkluderar men är inte begränsade till peptider, peptoider och N-metylerade peptider. Här beskriver vi en syntetisk metod som kombinerar både split-och-pool och strategier sub-monomera att syntetisera en en-pärla en substansbibliotek av trafikhuvudmän.
Abstract
Peptidhärmare är bra källor till protein-ligander. Den oligomera karaktären av dessa föreningar gör att vi kan få tillgång till stora syntetiska bibliotek på fast fas med hjälp av kombinatorisk kemi. En av de mest studerade klasser av peptidomimetiska är peptoids. Peptoider är lätta att syntetisera och har visat sig vara proteolys beständigt och cell-permeabel. Under det senaste decenniet har många användbara proteinligander identifierats genom screening av peptoid bibliotek. Men de flesta av de ligander som identifierats från peptoid bibliotek visar inte hög affinitet, med få undantag. Detta kan bero delvis på bristen på kirala centra och konforma begränsningar i peptoid molekyler. Nyligen beskrev vi en ny syntetisk väg att komma peptid tertiära amider (pesetas). Trafikhuvudmän är en superfamilj av peptidomimetika som inkluderar men är inte begränsade till peptider, peptoider och N-metylerade peptider. Med sidokedjor på både α-kol och huvudkedjan kväveatomer,konforma av dessa molekyler är kraftigt begränsade av steriska hinder och allyliska 1,3 stammen. (Figur 1) Vår studie tyder på att dessa PTA molekyler mycket strukturerad i lösning och kan användas för att identifiera proteinligander. Vi tror att dessa molekyler kan vara en framtida källa av hög affinitet proteinligander. Här beskriver vi den syntetiska metoden som kombinerar kraften i både split-och-pool och strategier sub-monomera att syntetisera ett prov en pärla en förening (OBOC) bibliotek med trafikhuvudmän.
Introduction
Peptidhärmande är föreningar, som efterliknar strukturen av naturliga peptider. De är utformade för att bevara bioaktiviteten samtidigt övervinna några av de problem som är förknippade med naturliga peptider, inklusive cell permeabilitet och stabilitet mot proteolys 1-3. På grund av den oligomera karaktären hos dessa föreningar kan stora syntetiska bibliotek lätt nås genom monomera eller sub-monomera syntesvägar 4-7. En av de mest studerade klasserna av peptidomimetiska är peptoids. Peptoider är oligomerer av N-alkylerade glyciner som kan syntetiseras enkelt med hjälp av en sub-monomer strategi 8, 9. Många användbara proteinligander har framgångsrikt identifierat från screening stora syntetiska peptoid bibliotek mot protein mål 1, 10-14. Ändå "träffar" som identifierats från peptoid bibliotek arkivera sällan mycket hög affinitet mot proteinmål 1,10-14,22. En major skillnaden mellan peptoider och naturliga peptider är att de flesta av peptoider allmänhet saknar förmågan att bilda sekundärstruktur på grund av avsaknaden av kirala centra och konformationsbegränsningar. För att lösa detta problem, har flera strategier som utvecklats under de senaste tio åren, till stor del fokuserar på ändring av sidokedjor som finns på de viktigaste kedja kväveatomer 15-22. Nyligen har vi utvecklat en ny syntetisk väg att införa naturliga aminosyrasidokedjor på en peptoid ryggrad att skapa peptid tertiära amider 23.
Peptid tertiära amider (pesetas) är en superfamilj av peptidhärmande molekyler som inkluderar men inte är begränsade till peptider (R 2 = H), peptoider (R 1 = H) och N-metylerade peptider (R 1 ≠ H, R2 = Me) . (Se figur 1) Vårt syntesväg sysselsätter naturligt förekommande aminosyror som källa för chiralitet och sidokedjorna på45;-kol, och kommersiellt tillgängliga primära aminerna för att ge N-substitutioner. Därför kan en större kemisk utrymme än för enkla peptider, peptoids eller N-metylerade peptider utforskas. Cirkulär dikroism spektra har visat att PTA molekyler är mycket strukturerad i lösning. Karakterisering av en av de PTA-proteinkomplex visar tydligt att de konformationsbegränsningar för tereftalsyra krävs för bindning. Nyligen har vi också upptäckt att vissa av PTA molekyler har förbättrat cellerpermeabilitet än sina peptoid och peptid motsvarigheter. Vi tror att dessa PTA bibliotek kan vara en bra källa till hög-affinitetsligander för protein mål. I denna uppsats kommer vi att diskutera syntesen av ett prov en pärla en förening (OBOC) PTA biblioteket i detaljer tillsammans med några förbättrade förutsättningar för koppling och klyvning av dessa föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grunderna i Split-och-pool Synthesis
För att effektivt generera ett stort antal föreningar i fast fas, är split-och-pool syntes ofta används som en allmän strategi. Såsom visas i figur 4, TentaGel pärlor är först delas upp i tre portioner. Varje del bringas att reagera med en annan reagens, som genererar den första resten på pärlor. Efter den första reaktionen, är alla tre delarna slås samman, blandas och delas sedan upp igen i tre portioner. Varje del kommer återigen reagera med en annan reagens, som genererar den andra återstoden på pärlor. Efter två split-och poolsteg, är nio föreningar genereras.
I sub-monomer-syntes, är pärlorna först delas upp i flera portioner för att reagera med olika bromsyror i närvaro av kopplingsreagens. Efter tvättning med lösningsmedel, kommer alla pärlor sammanföras och blandas, sedan återigen delas upp i flera delar för att reagera med olikaprimära aminer. Efter aminering är alla pärlor sammanförs och tvättas noggrant, slutföra en fullständig monomer på varje pärla. Denna process kan upprepas tills önskad mångfald uppnås.
2. Beredning av syrabromid från naturliga aminosyror
I sub-monomer-syntes, är syntesen av varje monomer uppdelad i två separata steg:. Ett kopplings av syra-bromid och 2 aminering med primära aminer (Figur 2).. För att syntetisera en peptid tertiär amid, kommer kirala syrabromider med sidokedjor på alfa-kolet framställas från naturliga aminosyror. Här beskriver vi ett förfarande för transformering av en naturlig aminosyra till motsvarande syrabromiden med hög stereo trohet. Vi använder alanin som ett exempel; andra aminosyror inklusive serin, treonin, asparaginsyra, glutaminsyra, asparagin, glutamin, glycin, valin, isoleucin, kan fenylalanin också omvandlas till bromsyror enligt liknande conditions. Observera att vissa av de aminosyror med funktionella grupper såsom fenol, guanidin och amin måste skyddas före omvandlingen. Reaktions inställning visas i fig 3.
Försiktighetsåtgärder: För följande reaktioner med HBr, NaNO 2 och andra frätande / giftiga kemikalier, lämplig skyddsutrustning som skyddsglasögon, skyddsrock och kemikalieresistenta handskar behövs. Alla synpunkter bör utföras i ett dragskåp med erfaren kemist.
- Lägg till 370 ml vatten i 630 ml 48% HBr-lösning för att förbereda en 1 L, 30% HBr-lösning. Tillsätt 500 ml etylenglykol i en 1 L bad behållare; lägga till torris för att hålla temperaturen vid -10 ° C. Varning: 48% HBr-lösning är starkt sura och frätande, handtag med omsorg. Läs säkerhetsdatablad före användning.
- Lägg till D-alanin (8,9 g, 0,1 mol) och KBr (11,9 g, 0,1 mol) till en 250 ml tre-halsad rundbottnad kolv med en magnetisk omrörarstav. Tillsätt 100 ml, och 30% HBr beredd ithan föregående steg. Placera kolven i etylenglykol-bad som framställts i steg 2,1 och hålla temperaturen vid -10 ° C. Bubbla argon genom en lång nål från bottnen av kolven under 10 minuter såsom visas i fig. 3 Rör om lösningen med magnetisk omrörare vid 300 varv per minut..
- Lös NaNO 2 (8,28 g, 0,12 mol) i en 100 ml bägare med 20 ml vatten. Sätt lösningen in i tryckutjämnande dropptratt och försegla dropptratten med ett septum. Vrid långsamt på ventilen på dropptratten och låt Nano 2 lösningen falla ner i kolven. Styra ventilen för att justera dropphastigheten till ca 2 droppar per sekund. Håll under omröring vid 300 varv per minut och hålla argon bubbling från botten av kolven. Kolven bör hållas i etylenglykol-bad vid -10 ° C tills all NaNO 2 tillsättes. Varning: Detta steg alstrar värme och gas under tillsatsen av NaNO 2-lösning. Droppande kursen borde vara noga kontrollerad och hela systemet måste vara öppet genom argon utlopp.
- Håll omrörning under 3 mer h och låta temperaturen värmas upp från -10 ° C till rumstemperatur. Den erhållna lösningen ska vara klar till ljusgul; om färgen är för mörk, anbringa vakuum för att avlägsna överskott av kväveoxider och eventuellt Br2 genereras under reaktionen.
- Extrahera produkten från lösningen med 3 x 35 ml dietyleter med användning av ett extraherande tratt. Kombinera den organiska fasen och tvätta den med mättad saltlösning. Den organiska fasen kan även tvättas med en liten mängd NaHCOa 3 före tvättning med koksaltlösning för att ta bort färg, om det är mörkt. Torka den organiska fasen över Na 2 SO 4 till 6 timmar.
- Filtrera ut Na 2 SO 4 och indunsta lösningsmedlet under vakuum, bör råa produkten erhållas såsom klar till svagt gul olja. Råprodukten kan renas ytterligare genom destillation vid 115 ° C, 3 mm Hg, eller genom attsilikakolonn med 03:01 hexan: etylacetat.
- Ren produkt erhålles i form av klar olja, 6,6 g (utbyte 74%), densitet = 1,69 g / ml, [α] D20 = 24 ° (metanol), 1 H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). I fallet med (S)-2-brompropansyra-d4 (framställd från d 4-L-alanin), den rena produkten erhölls i form av klar olja, utbyte 78%, densitet = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (metanol). 1H NMR, ingen signifikant H-signal observeras. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (förväntad 154,97). Till (S)-2-brom-4-metylpentansyra (framställd av L-leucin med användning av samma procedur) ren produkt erhålles i form av klar olja, utbyte 89%, [α] D20 = 37 ° (metanol), en H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 4,30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). I fallet med (S)-2-brom-3-phenylpropanoic syra (framställd av L-fenylalanin med användning av samma procedur) ren produkt erhålles som en blekgul olja, utbyte 72%, [α] D20 = 17 ° (metanol), 1 H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7,38 - 7,19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8,1, 7,3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14,2, 8,2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14,2, 7,2 Hz, 1 H).
3. Isotopic Märkning av alanin Använda transa
I kombinatoriska bibliotek syntes, särskilt i split-och-pool syntes av en pärla en-ämnen (OBOC) bibliotek, är den mängd av förening som kan erhållas från varje pärla relativt liten. (Normalt 1 pmol till 10 nmol). Dessutom är masspektrometri allmänt används för identifiering och karakterisering av den slutliga föreningen på grund av dess höga känslighet. För att kunna använda masspektrometri för att bestämma den absoluta stereokemin vid de chirala centra i de slutliga PTA produkter bör brom syra enantiomererna vara isotopically märkta före användning. Här beskriver vi ett förfarande för användning av transaminas och D 2 O till etiketten L-alanin.
- Lös L-alanin (300 mg, 3,36 mmol) med 10 ml av D2O i ett 50 ml polyetenrör. Lägg α-ketoglutarat (10 mg, 0,068 mmol) som co-substrat. Värm upp röret till 37 ° C och justera pD till 8,5 till 8,7 med användning av en 1 M NaOD klicka på länken. OBS: pD avgörs av pH-teststickor. Traditionell electro pH-mätare försedd med glaselektrod selektiv för H + kan ge felaktiga läsa upp för D +.
- Lägg alaninaminotransferas (0,1 mg, EC 2.6.1.2 från grishjärta, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) till pD 8,5-8,7, 37 ° C lösning framställd från föregående steg. Placera röret i en 37 ° C inkubator och inkubera över natten med lätt skakning, är 10 till 30 varv per minut föredrages.
- Efter inkubation över natten, tar 0,5 ml av D2O lösning och kontrollera reaktionens fortskridande genom ett H-NMR. Alla protonsignaler i enlanine, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1 H-NMR 400 MHz, bör i hög grad undertryckt på grund av deuterering. Mer än 98% av proton bör utbytas till deuterium som beskrivits tidigare 23. Anm: D2O delvis kan återvinnas genom destillation, om reaktionen utföres i stor skala (> 200 ml D2O). Normalt kan 60% till 80% av D2O destilleras från lösningen.
- Frys den ovannämnda lösningen med flytande kväve och lyofilisera den med en lyofilisator för att erhålla vit deutererad L-alanin-pulver.
4. Syntes av peptoid Linker Region
Linkern region krävs inte för PTA bibliotekssyntes. Men i syfte att undvika hög bakgrund i lägre molekylviktsområdet (100-600) av MALDI masspektroskopi och för att förbättra joniseringen av föreningarna, en peptoid linker med flera polära rester används ofta. Detta peptoid linker kan syntetiseras genom standard peptoid syntesförfarande. Här kommer vi att syntetisera en pentamer av N-metoxietyl glycin som linker (såsom visas i fig 5).
- Swell 90 fim TentaGel pärlor med RAM-linker (1 g, 0,27 mmol / g) i 10 ml DMF under 3 h i en 12 ml spruta reaktor med mild skakning.
- Tappa av DMF från reaktorn och tillsätt 10 ml 20% piperidin DMF-lösning för att avskydda Fmoc-gruppen från Rink amid linker. Skaka av pärlorna med 20% piperidinlösning i 30 min. Tvätta med DMF 5x för att ta bort alla piperidin.
- Ta några pärlor ur sprutan och testa den med kloranil test. Pärlor ska vända mörkbrun (kloranil testar positivt för primär amin) om fmoc framgångsrikt avskyddas.
- Bered följande lösningar: 1. 20 ml, 2 M bromättiksyra / DMF-lösning; 2 20 ml, 2 M DIC / DMF-lösning.; 3. 10 ml, 1 M methoxylethylamine / DMF-lösning.
- Tillsätt 5 ml 2 M bromättiksyra / DMF-lösning tillpärlorna, skaka försiktigt. Tillsätt sedan 5 ml 2 M DIC / DMF-lösning till pärlorna; försegla sprutan med kolven och placera den på shaker. Skaka om under 10 min.
- Tvätta pärlorna med DMF noggrant. Tillsätt 2 ml 1 M metoxietylamin / DMF-lösning som framställts från steg 4,4 till pärlorna. Förslut sprutan med kolven och skaka den på shaker i 30 min.
- Tvätta pärlor med DMF 5x. Kontrollera några pärlor med kloranil test, om positiva (pärlor blir blå), fortsätt sedan till nästa steg. Annars upprepar steg 4.6.
- Upprepa steg från 4,5 till 4,7, 4x för att slutföra pentameren.
. 5 Split-och-pool Syntes av PTA bibliotek med (R) - och (S)-2-brompropionsyra syror
Här beskriver vi syntesen av en liten PTA-bibliotek med en teoretisk mångfald 9261 föreningar med användning av den 1 g pärlor från steg 4,8. Observera att en 90 ìm TentaGel pärla innehåller cirka 2,9 miljoner pärlor per gram; därför redundansen hosbiblioteket kommer att vara 2,9 x 10 6/9261 = 312 kopior. Vi kommer att använda bromättiksyra, (R)-2-brompropan och isotopmärkt (S)-2-brompropansyra-d4 som de syror och 7 olika aminer (A1 ~ A7, se Figur 5 för detaljer) för aminering. Spruta reaktorer och en vakuumgrenrör kommer att användas för att utföra syntesen.
- Tillsätt 10 ml 01:01 DCM: DMF till sprutan från steg 4,8; Använd en 1000 l pipett med en stympad pipettspets att dela alla 1 g pärlor jämnt i tre 5 ml spruta reaktorer. Märk dem såsom B (bromättiksyra), R ((R)-2-brompropan) och S ((S)-2-brompropansyra-d4). Tvätta alla 3 sprutor med DCM 3x, och tvätta sprutor märkta med R och S med vattenfri THF 3x, tvätta sprutan märkt med B med DMF 3x.
- Spruta R och S. BTC koppling av brompropansyra.
- Bered en färsk BTC / THF-lösning. Lägg till enpproximately 200 mg BTC i flaskan i ett dragskåp, försegla den med locket. Väg mängden BTC i flaskan. Beräkna mängden lösningsmedel behövs och lägga vattenfri THF i flaskan för att göra en 20 mg / ml BTC / THF-lösning.
- Förbered brom syror / BTC blandning. Lägg till (R)-2-brompropansyra (89 | il, 0,95 mmol) och (S)-2-brompropansyra-d4 (89 | il, 0,95 mmol) i två små vialer separat. För varje flaska, tillsätt 5 ml av den över 20 mg / ml BTC / THF-lösning. Täta de två flaskorna och lägg dem i -20 ° C frys i 20 min.
- Lägg 1125 pl, 02:01 THF / DIPEA (750 | il THF, 375 jil DIPEA, 2,2 mmol) för att spruta R och S var för sig. Blanda pärlorna med pipettspetsen. Låt dem sitta i 5 minuter.
- Ta två kylda brom syror / BTC blandningar från steg 5.2.2, till 2,4,6-trimetylpyridin (356 pl, 2,7 mmol) till var och flaskor. Vita fällningar bildas omedelbart. Applicera motsvarande fjädring direktatt de gjordes basisk pärlor (spruta R och S i steg 5.2.3) så snart som möjligt och sedan lägga dem på en shaker skaka i 120 rpm i 2 timmar.
OBS: Lösningen i sprutan reaktorerna ska vara en blek gulaktig suspension under hela reaktionsförloppet. En mörkare färgen är en indikation på överdriven värme som frigörs under den initiala tillsatsen av syrakloridlösningen. Detta kan lösas genom ytterligare nedkylning eller späda brom syror / BTC blandning.
- B spruta. Bromättiksyra koppling med DIC
- Bered en färsk 20 ml, 2 M bromättiksyra / DMF-lösning. Förbered en 20 ml, 2 M DIC / DMF-lösning.
- Tillsätt 2 ml 2 M bromättiksyra / DMF-lösning för att spruta B, skaka försiktigt. Tillsätt 2 ml 2 M DIC / DMF-lösning för att spruta B, skaka försiktigt.
- Sätt sprutan B på samma shaker som spruta R och S
- Efter 2 timmar, ta sprutan R, S och B från shakern. Tvätta alla tre sprutor noggrant med DCM 5x. Tvätta sedan med DMF 5x. Observera att spruta R och S kan inte tvättas med DMF innan de tvättas med DCM eller THF först.
- Pool alla pärlorna från sprutor R, S och B i en 12 ml spruta reaktor. Tvätta alla pärlorna med DMF 5x.
- Tillsätt 10 ml 01:01 DCM: DMF till sprutan; Använd en 1000 l pipett med en stympad pipettspets att dela upp alla pärlor jämnt i 7 individuella 2 ml sprutor, märka dem som A1-A7.
- Aminering. Förbered 10 ml, 2 M primära amin / DMF-lösningar för var och en av de 7 aminer som förtecknas i Figur 5. Tillsätt 5 ml each aminlösning till motsvarande spruta A1-A7. Inkubera alla 7 sprutor i en 60 ° C inkubator med skakning över natten.
- Efter inkubation, tvätta alla pärlor noggrant med DMF. Ta några av pärlor från varje spruta och kolla med kloranil test. Om pärlorna blir gröna (positivt) inom 3 minuter, fortsätt med nästa steg. Om negativt, upprepa steg 5.7 för de negativa sprutor.
- Upprepa steg 5,1-5,8 2x för att slutföra trimeren. Valfritt steg: Efter varje cykel rekommenderar vi att kontrollera syntesen av god kvalitet genom mass-spektroskopi såsom beskrivs nedan. Alla 9261 föreningar nu syntetiseras på TentaGel-kulor som OBOC bibliotek.
- Mass-spektroskopisk bekräftelse på trafikhuvudmän.
Trafikhuvudmän är mycket strukturerade oligomerer och har många gemensamma drag i N-metylerade peptider. Ett av de vanligaste problemen med fastfassyntes av N-metylerade peptider är syranedbrytning under TFA-klyvning. För att undertrycka syranedbrytning, klyvning av molekyler som cyklosporin frånfast bärare utförs ofta under låg temperatur. Vi jämförde olika klyvningsförhållanden för att klyva olika PTA-molekyler från den fasta bäraren. Vi fann att, i allmänhet, låg temperatur och minskad TFA koncentrationen kan effektivt undertrycka syranedbrytning och ger renare föreningar.- Bered 10 ml 01:01 TFA / DCM-lösning i en 15 ml tub. Förslut röret och placera den i en -20 ° C frys i 20 min.
- Tvätta pärlorna som måste klyvas med DCM 5x. Skaka pärlorna i DCM under 15 min och tvätta pärlorna på nytt med DCM 5x.
- Tappa av DCM från sprutan. Använd ett ljusmikroskop och en pipett med stympad spets för att överföra varje enskild kula i en 96-brunnars platta, en pärla per brunn.
- Täck 96-brunnar med ett täckglas. Placera plattan i en -20 ° C frys under 15 min.
- Ta den kylda 01:01 TFA / DCM-lösningen från steg 5.10.1 och tillsätt 20 | il till varje brunn som innehåller en vulst. Sätt locket glida tillbaka och put i 96-brunnsplatta i en skakapparat vid -20 ° C kylskåp.
- Skaka om under 20 min. Ta 96-brunnar ut och dra av täckglas. Föna TFA / DCM från varje brunn genom att blåsa luft eller argon över den. Om mer än 10 pärlor klyvs, kan en speedvac användas för att torka den TFA / DCM från hela plattan. Notera att vid denna punkt, inte alla av föreningarna avspjälkas pärlorna, men de kluvna föreningarna bör vara mer än tillräckligt för att utföra masspektroskopi analysen.
- Tillsätt 20 l 6:04 ACN: H 2 O För att lösa upp de kluvna föreningar från varje brunn. Spot 0.6 l av varje förening lösning tillsammans med 0,6 pl CHCA MALDI matris på MALDI plattan.
- Använd MALDI masspektrometri för att bestämma molekylvikten och sekvensen (MS / MS) av varje förening.
6. Kloranil Test
- Förbered följande reagenser fräsch för varje test. Lösning A: 2% kloranil (CAS: 118-75-2) i DMF. LösningB: 2% acetaldehyd (CAS: 75-07-0) i DMF.
- Blanda 100 pl lösning A med 100 pl av lösning B före testet i ett 1,5 ml rör; släppa pärlorna i och försiktigt skaka. Om pärlorna blir blå inom 5 minuter, indikerar det närvaron av den sekundära aminen på ytan av pärlorna. Primära aminer ger en mörkbrun färg istället för att vända blått.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi tre representativa MALDI spektrum från en PTA trimer med länkaren. Såsom visas i figur 6A, när klyvas under rumstemperatur med användning av 50% TFA / DCM-lösning, signifikant nedbrytning observerades. I figur 6A, topp 593 och 484 motsvarar länkaren och PTA trimeren respektive, visar att hela molekylen framgångsrikt syntetiseras på pärla men bryts ner vid klyvning. När klyvas under villkoret låg temperatur, såsom beskrivits ovan, är mängden av TFA-inducerad nedbrytning kraftigt undertrycks, såsom visas i fig. 6B. Mekanismen för sådan klyvning har beskrivits i tidigare litteratur 24, och det antas att gå igenom en oxazolidin-mellanprodukt. PTA-molekyler kan sekvenseras genom MS / MS och fragmenteringsmönstret är liknande till det av peptider och peptoider, såsom visas i fig. 6C. PTA-molekylerna syntetiserade med (S)-2-brompropansyra-d4 generellt give bredare topp på MS-och MS / MS-spektra på grund av närvaron av ofullständiga deuterering produkter, såsom (S)-2-brompropansyra-d 3 (figurerna 7a och 7b). Detta kan användas som en indikation på närvaron av R chiralcentrum (inverterad från S under aminering) under sekvenseförfarandet. Vi fann också att PTA-molekyler har en tendens att bilda mer sodiated addukter än peptoid / peptid, därför låg natrium vatten (t.ex. avjoniserat vatten) och plast anordning är föredragna (figur 7C). En annan biprodukt som kunde observeras i PTA syntes är akrylamid bildas från eliminering av bromid under amina (figur 7C). När akrylamid bildas, sekvensen avslutas. Detta kan lösas genom att sänka koncentrationen av den primära aminen till en M i syfte att minska basiciteten hos lösningen. Vi rekommenderar utför kloranil test efter varje acyleringssteg och använda mass spectroscopy att kontrollera produkten efter varje amineringssteg för att säkerställa kvaliteten på biblioteket.
Figur 1. Strukturell jämförelse av peptid, peptoid, PTA och N-metylerade peptiden. PTA innefattar peptiden (R 2 = H), peptoid (R 1 = H) och N-metylerade peptiden (R 1 ≠ H, R2 = Me) . B) PTA föredrar trans amidbindningen konformation på grund av steriska hinder mellan två α-sidokedjan. C) PTA har också en föredragen konformation på grund av 1,3 allyliska stam mellan N-substitut och α-sidokedjan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Under monomer syntes av peptoid (R 1 = H) och (R 1 ≠ H). Första steget är syran acylering av aminen PTA. Andra steget är aminering med primära aminer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Reaktion setup. En 250 ml tre-halsad rundbottnad kolv placeras i en torr is / etylenglykol-bad. Den mellersta hals är förbunden med en 150 ml tryckutjämnande dropptratt. Vänster och höger halsar är förseglade med en flödeskontrolladapter och ett septum wed en lång nål som gör argonflöde passera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Grunderna i split-och-pool syntes. Blanka pärlor är uppdelade i tre delar, behandlas separat med reagens A, B och C. Efter den första reaktionen, alla tre delar av pärlor sammanförs och blandas. Sammanslagna pärlor delas igen i tre delar och återigen behandlas med samma reaktant för varje enskild del. Efter den andra reaktionen är 9 olika föreningar syntetiseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bibliotek struktur översikt. Tre trafikhuvudmän syntetiseras efter pentameren peptoid länkaren. Teoretisk mångfald, 3 3 X 7 3 = 9261. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Typiska MALDI masspektrum av en PTA-trimer. A) Trimer PTA klyvs av 50% TFA / DCM i rumstemperatur. PTA struktur som visas, [M +1] ^ = 1077, [M + Na] ^ = 1,098.9, PTA fragmentering från TFA-klyvning kan tydligt ses på spektrumet. B) Trimer cleaved av 50% TFA / DCM under optimerade betingelser som beskrivs i artikeln. TFA-inducerar nedbrytning yran är kraftigt undertryckt. C) MS / MS-spektrum av PTA trimer. Svag Y7 (916) signalen observeras, är detta ett typiskt fragmentering beteende för trafikhuvudmän. Spectra analyseras och genereras av mmass 32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. MALDI-spektra för PTA-syntes med isotopmärkt monomeren och typiska biprodukter. A) MS-spektra jämförelse av PTA-molekyler syntetiseras av blå: (R)-2-brompropan [M +1] ^ = 760 [M + Na] ^ = 787 [M + K] ^ = 803 och röd: (S) - 2-brompropansyra-d4 [M +1] + = 764 [M + Na] ^ = 783 [M + K] + = 799. B) MS / MS-fragmenteringsmönster för de två molekylerna som visas i A). Observera att på grund av närvaron av d 1, d 2 d 3 kryddor (ofullständig deuterering av alanin), molekyler som syntetiseras av (S)-2-brompropansyra-d4 allmänhet ger bredare toppar C) Röd:. Spektrum av en PTA dimer syntetiseras och spjälkas under optimerat tillstånd. Blå:. PTA dimer syntetiseras med 2 M metoxietylamin lösning och klyvs i normalt filtrerat vatten Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Peptid tertiära amider (pesetas) är en superfamilj av peptidomimetiska oligomerer. Förutom de väl studerade peptider, peptoider och N-metylerade peptider, förblir en stor del av föreningarna inom denna familj understudied, majorly grund av brist på syntetisk metod för att komma allmänna N-alkylerade peptider. Här beskriver vi en effektiv metod för att syntetisera trafikhuvudmän med kirala byggstenar härledda från aminosyror. Tidigare har vi rapporterat att använda en ny sub-monomer väg till syntes bibliotek av PTA molekyler 23. Vi har visat att trafikhuvudmän är mycket strukturerade oligomerer som uppvisar konformaförankringar genom ryggraden. Vid test in vivo, PTA molekyler visade förbättrad cell permeabilitet och därmed förbättrad aktivitet 25. Men tillsammans med alla fördelar, trafikhuvudmän också komma med några syntetiska utmaningar, majorly från acyleringen av sekundära aminer vid hindrade positioner. Den α-sidokedja, vilken innehåller konformabegränsning innebär också steriskt hinder för följande kopplingssteget. För att övervinna dessa syntetiska utmaningar, utförde vi en omfattande optimeringsstudie och bestäms BTC som den bästa kopplingsreagens för denna reaktion 23.
Det viktiga steget i syntesvägen är BTC underlättas acylering av den sekundära aminen. Under denna process, BTC möjliggör genereringen av en syraklorid in situ 26,27. De flesta andra kopplingsreagens, som utgör antingen aktiva estrar eller syraanhydrider som mellan misslyckats med att ge ren acylering för kontinuerlig PTA syntes. Förekomsten av tidigare PTA heter försämrar kraftigt kopplingen effektivitet följande PTA enheten på grund av steriskt hinder. Därför, för syntes av flera trafikhuvudmän, en mycket aktiv mellanprodukt med en liten lämnande grupp är starkt föredraget. Bland alla kopplingsförhållanden som vi testade, in situ-genererade syraklorid genom BTC fungerar best i vår hand. Men även med de högaktiva syraklorider rekommenderar vi att undvika starkt steriska hindrade aminer, såsom α-förgrenade primära aminer i bibliotekssyntes om inte testas i förväg. Aromatiska aminer såsom Aniles ofta leda till ofullständig substitution och sålunda bör också undvikas. Under BTC kopplingssteget ska lösningen alltid vara en blekt gul till orange färg; en mörkare färgad lösning är ett tecken på överhettning och kan leda till lägre avkastning och ökad bildning av biprodukter. Detta kan i allmänhet lösas genom ytterligare kylning av BTC-lösning, minska storleken på reaktionen och snabbare överföring av det aktiverade BTC / syralösningen. Förutom BTC, ,2-dihydrokinolin (EEDQ) är N-etoxikarbonyl-2-etoxi-1 en annan kopplingsmedel som fungerar bra i PTA syntes. Den viktigaste mellanprodukt är en blandad kolsyra-anhydrid med en relativt liten lämnande grupp. I fallet med EEDQ, är 3 ekvivalent av EEDQ löses tillsammans med syran i DCM och sedan applied till pärlorna vid rumstemperatur. Reaktionen utförs normalt inom 2 h med mild skakning. Denna reaktion frigör CO2 under reaktionen; därför kan beträffande reaktionssystemet bör inte stängas.
Ett annat viktigt steg är att klyvning och karakterisering av PTA molekyler. Ett utmärkande MS / MS fragmentering mönster har observerats vid sekvense PTA molekyler via MALDI-MS/MS (Figur 6). Den består med en låg intensitet av de y senaste jon (som visas i lila i fig 6C och ökad intensitet Y6, Y5, Y4, B2, B3 joner). Analoga mönster har observerats från N-metylerade peptid fragmentering i föregående rapport 28. På grund av den ökade stabiliteten hos den intermediära oxazolidin, N-metylerade peptider tenderar att ge starka b joner 28. Dessutom är det väl känt att N-metylerade peptiden är syralabila under såväl TFA klyvning och MALDI-masspektroskopi 24,28, 29. Mekanistisk studie har visat att på grund av konformationella restriktioner på huvudkedjan, är karbonyl syreatom av den föregående återstoden ofta i närheten av karbonylgruppen vid klyvningsstället, vilket främjar bildningen av oxazolidin intermediär 29. Av de skäl som nämnts ovan, både trafikhuvudmän och N-metylerade peptider måste klyvas från fasta underlag vid låg temperatur med hjälp av kontrollerade koncentrationer av TFA 26, 30. Enligt vår erfarenhet, inträffar den mest praktiska klyvningsmetoden för enskilda PTA rester vid -20 ° C med en i förväg kyld, -20 ° C lösning av 50% TFA / DCM. Detta förfarande trycker kraftigt bildandet av sura nedbrutna produkter.
Efter att bemästra denna teknik kan bibliotek med PTA monomer härledd från andra naturliga aminosyror, såsom leucin, fenylalanin, glutamin, etc. syntetiseras också. En hög kvalitet PTA bibliotek kan screenas against olika målproteiner som använder våra tidigare publicerade på-pärla screening protokoll 31. Hit föreningar som identifierats i granskningen kan karakteriseras av masspektroskopi och återsyntetiseras för ytterligare test med det protokoll som beskrivs ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Jumpei Morimoto och Dr Todd Doran för värdefull hjälp. Detta arbete stöddes av ett avtal från NHLBI (NO1-HV-00242).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6 trimethylpyridine | ACROS | 161950010 | CAS:108-75-8 |
| 2-morpholinoethanamine | Sigma-Aldrich | 06680 | CAS:2038-03-1 |
| 48% HBr water solution | ALFA AESAR | AA14036AT | CAS:10035-10-6 |
| Acetaldehyde | Sigma-Aldrich | 402788 | CAS:75-07-0 |
| Acetonitrile | Fisher | SR015AA-19PS | CAS:75-05-8 |
| Anhydrous tetrahydrofuran (THF) | EMD | EM-TX0277-6 | CAS:109-99-9 |
| Benzylamine | Sigma-Aldrich | 185701 | CAS:100-46-9 |
| bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) | ACROS | 258950050 | CAS:32315-10-9 |
| Bromoacetic acid | ACROS | 106570010 | CAS:79-08-3 |
| Chloranil | Sigma-Aldrich | 23290 | CAS:118-75-2 |
| Cyclohexanemethylamine | Sigma-Aldrich | 101842 | CAS:3218-02-8 |
| D2O | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8-1000 | CAS:7789-20-0 |
| D-Alanine | Anaspec | 61387-100 | CAS:338-69-2 |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher | BJ-NS300-20 | CAS:75-09-2 |
| Dimethylformamide (DMF) | Fisher | BJ-076-4 | CAS:68-12-2 |
| Ethylene glycol | Oakwood | 44710 | CAS:107-21-1 |
| Isopentylamine | Sigma-Aldrich | W321907 | CAS:107-85-7 |
| KBr | ACROS | 424070025 | CAS:7758-02-3 |
| L-Alanine | Anaspec | 61385-100 | CAS:56-41-7 |
| 3-Methoxypropylamine | Sigma-Aldrich | M25007 | CAS:5332-73-0 |
| 2-Methoxyethylamine | Sigma-Aldrich | 143693 | CAS:109-85-3 |
| N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone | Sigma-Aldrich | 136565 | CAS:7663-77-6 |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | ACROS | 115211000 | CAS:693-13-0 |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma-Aldrich | D125806 | CAS:7087-68-5 |
| NaNO2 | ACROS | 424340010 | CAS:7631-99-4 |
| NAOD 40% solution in water | ACROS | 200058-506 | CAS:7732-18-5 |
| Piperidine | ALFA AESAR | A12442-AE | CAS:110-89-4 |
| Piperonylamine | Sigma-Aldrich | P49503 | CAS:2620-50-0 |
| Propylamine | Sigma-Aldrich | 240958 | CAS:107-10-8 |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | CAS:76-05-1 |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 39468 | CAS:28166-41-8 |
| α-Ketoglutarate | ALFA AESAR | AAA10256-22 | CAS:328-50-7 |
| Tentagel Resin with RINK linker | Rapp-Polymere | S30023 | |
| Alanine transaminase | Roche | 10105589001 | AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT) |
| Incubator | New Brunswick Scientific | Innova44 | |
| NMR | Bruker | 400 MHz | |
| MALDI mass spectrometer | Applied Biosystems | 4800 MALDI-TOF/TOF | |
| Lyophilizer | SP Scientific | VirTis benchtop K | |
| Syringe reactor | INTAVIS | Reaction Column | 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 | Vac-Man |
References
- Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
- Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
- Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
- Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
- Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
- Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
- Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
- Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
- Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
- Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
- Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
- Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
- Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
- Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
- Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
- Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
- Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
- Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
- Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
- Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
- Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
- Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
- Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8 (10), 2312-2321 (2013).
- Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
- Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
- Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
- Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
- Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
- Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).
