Продольная Измерение внеклеточного матрикса жесткости в 3D Опухолевые модели с помощью частиц отслеживания микрореология

Summary

Микрореология частиц отслеживания может быть использован для неразрушающего количественного и пространственно карту изменений в внеклеточного матрикса механических свойств в 3D моделей опухолей.

Abstract

Механический микросреда как было показано, действовать в качестве важнейшего регулятора поведения роста опухоли и сигнализации, которая сама отремонтирован и модифицированной в рамках набора сложных, двусторонняя механочувствительных взаимодействий. В то время как развитие биологически-соответствующих 3D моделей опухолевых способствовали механистические исследования о влиянии матрицы реологических на рост опухоли, обратная задача изменения отображения в механической среде, вызванной опухолями остается сложной. Здесь мы описываем реализацию частиц отслеживания микрореологические (PTM) в сочетании с 3D моделями рака поджелудочной железы в рамках надежной и жизнеспособной подхода для продольно мониторинга физические изменения в опухоли микроокружения, на месте. Описываемая здесь методология интегрирует систему подготовки в пробирке 3D модели, внедренные в модели внеклеточного матрикса (ECM) лесов из типа I коллагена с флуоресцентной меченые зонды, равномерно распределенное для роsition-и нестационарные измерения микрореология всей образца. опухоли в искусственных условиях высевают и исследовали в параллельных условиях с использованием многоямного рентгенографические пластины. Опираясь на установленных методов, видео трассирующих движений зонда превращаются через отношение Обобщенная Стокса Эйнштейна (GSER) представить сложную частотно-зависимого модуля сдвига вязкоупругая, G * (ω). Потому что такой подход является визуализация на основе механической характеристики также отображается на больших передается освещенности пространственных областях одновременно сообщить качественные изменения в 3D размера опухоли и фенотипа. Представитель результаты, показывающие контрастные механическую ответ в субрегионов, связанных с локализованным вторжения вызванной деградации матрицы, а также калибровки системы, данные по валидации представлены. Нежелательные результаты от общих экспериментальных ошибок и устранения неисправностей этих вопросов также представлены. 96-а 3D формате культура покрытие реализованы в этом протоколе есть сonducive соотношению измерений микрореология с терапевтическими скрининга или молекулярной визуализации, чтобы получить новое понимание влияния лечения или биохимических раздражителей на механической микросреды.

Introduction

Как видно из растущего организма доказательств в литературе, что раковые клетки, как и доброкачественных эпителиальных клетках млекопитающих, очень чувствительны к механическим и биофизических свойств окружающей внеклеточного матрикса (ECM) и других компонентов микроокружения ^1-9. Элегантные механистические исследования предоставили понимание роли внеклеточной жесткости как сложной механочувствительных партнера сигнализации, которая регулирует злокачественную поведение роста и морфогенеза ^2,3,10,11. Эта работа была облегчена, в частности, развития 3D в пробирке опухолевых моделях, которые восстанавливают биологически соответствующую архитектуру ткани и могут быть выращены в каркасных материалов с перестраиваемой механики и отображаемого с помощью оптической микроскопии ^12-19. Однако, с другой стороны этого mechanoregulatory диалога между опухолью и микросреды, через который раковые клетки в свою очередь изменяет реологические свойства их окружения, остается несколькотруднее учиться. Например, во время нашествия процессов, клетки на периферии опухоли могут претерпевать эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) и увеличения экспрессии матриксных металлопротеаз (ММР), которые вызывают местный деградацию внеклеточного матрикса ^20-22, который, в свою очередь, влияет на поведение механочувствительных роста другие проксимальных опухолевые клетки. С помощью различных биохимических процессов, раковые клетки непрерывно набрать местную жесткость окружающей их среды вверх и вниз в соответствии с различными процессами в разное время. Описываемая здесь методология мотивируется необходимостью аналитических инструментов, которые сообщают местные изменения в жесткости и соответствия ЕСМ в процессе роста, которые могут быть интегрированы с 3D моделей опухоли и коррелирует продольно биохимических и фенотипических изменений, не выключая культуру.

В поисках подходящей техники для реализации в этом контексте, частица отслеживания микрореология (PTM) выступает как сильного кандидата.Этот метод, впервые первоначально Мейсон и Вайц ^23,24, использует движение трассирующих зондов, встроенных в комплексной жидкости сообщить комплексный модуль частотно-зависимого сдвига вязкоупругая, G * (ω) при длине микронных масштабах. Этот общий подход был разработан с несколькими вариациями подходят для различных применений в мягких конденсированных сред, коллоидов, биофизики и физики полимеров ^25-31. PTM имеет определенные преимущества по сравнению с другими методами, так как показания местного вязкоупругости предоставляются неразрушающего видео визуализации биохимически неактивных меченых зондов, которые включены в момент подготовки культуры и оставаться на месте в течение продолжительных периодов роста. Это в отличие от золота стандартных измерений с колебательной сдвига объемной реометре, который обязательно требует прекращения культуры и сообщает объемную макроскопического реологические свойства образца, а не точечных измерений в рамках комплексной 3D опухоли microenvirютере. Действительно ряд исследований показано полезность интерпретации измерения движений трассирующими зонда в или вокруг раковых или не раковых клеток для измерения деформации, связанные с клеточной миграции ^32, механическим нагрузкам, вызванной расширяющейся сфероида ^33, внутриклеточного реологии ^34,35, и для сопоставления механических напряжений и деформаций в инженерных тканей ³⁶ и соотношение между размером пор и скорости вторжения ^37. Другие методы, подходящие для микрореологические, такие как атомно-силовой микроскопии (АСМ) может быть реализован, но, прежде всего, для зондирования точки на поверхности образца, а также может представлять проблемы стерильности культуры, которые усложняют продольные измерений ^38.

Здесь мы описываем комплексный протокол, охватывающий методы для роста 3D опухолевых сфероидов, пригодных для передачи в ECM со встроенными флуоресцентных зондов для видео частиц отслеживания и анализа методов надежно отображения пространственныеизменения в микрореологические с течением времени в культуре. В текущей реализации, модели 3D опухолевые выращивают в многоямного формате с целью к включению измерений микрореология с другими традиционными анализами (например, цитотоксичность), которые этот формат способствует. В этом представительного иллюстрации данной методики мы, в культуре пробирке 3D сфероидов с использованием PANC-1 клетки, установлено, линия поджелудочной железы раковые клетки, как известно, образуют сфероидов ^39, но все измерения, описанные здесь, могут широко применяться для изучения солидных опухолей с использованием различных клеточных линий подходит для 3D культуры. Поскольку этот метод по своей сути визуализации на основе он идеально подходит для совместного регистрации микрореология данных высокого разрешения с большими передается-световых полей зрения, которые сообщают изменения в клеточного роста, миграции и фенотипа. Осуществление PTM интегрирована с передаваемой световой микроскопии таким образом предполагает, воспроизводимое позиционирование микроскопа стадии Whич как правило, доступны на моторизованных коммерческий Widefield эпифлуоресцентной биологических микроскопов. Протокол, разработанный ниже, могут быть реализованы с любым разумно оборудованный автоматизированный флуоресценции биологического микроскопа. Само собой, это данные с интенсивным методом, который требует получения гигабайт цифровых данных видео микроскопии для автономной обработки.

В следующем протоколе Протокол 1 относится к первоначальной подготовки опухолевых сфероидов, который описанных здесь с помощью наложения на агарозе но могут быть замещены различными другими способами, такими как висит капли ⁴⁰ или ⁴¹ поворотного культуры методов. Протокол 2 описывает процесс встраивания сфероидов в коллагеновой строительные леса, хотя в качестве альтернативы, в пробирке 3D опухоли могут быть выращены инкапсуляции или вложения ресуспендировали клеток в ECM ^12,15, а не отдельных предварительно сформированных неадгезивных сфероидов. Последующие протоколы описывают процедуры для Øbtaining временным разрешением измерения микрореология путем приобретения и обработки данных видео микроскопии, соответственно. Обработка данных описывается с помощью MATLAB, используя процедуры с открытым исходным кодом для PTM построен на алгоритмах первоначально описанных Крокер и Грира ^42, который также широко развитой для различных программных платформ (см. http://www.physics.emory.edu/ ~ недели / IDL /).

Protocol

1. Культивирование Опухолевые Сфероиды Смешайте 10 мл сорта культуры клеток воды с 0,1 г агарозы, чтобы получить 1%-ный раствор агарозы. Тепло раствор агарозы в свыше 70 ° С (примерно 14 сек в стандартном микроволновой печи или с помощью нагревательной плитке) до аликвоты 40 мкл раст…

Representative Results

Чтобы убедиться в справедливости G * (ω) измерений в локализованных должности в сложной опухоли модель микросреды, были проведены два начальных проверочные эксперименты. Во-первых, мы стремились утвердить наши измерения против "золотого стандарта" объемной колебательной рео?…

Discussion

В этом протоколе введем надежную и широко применимый стратегию продольно отслеживания локальные изменения в ECM жесткости в моделях 3D опухолей. Мы предполагаем, что эта методология может быть принят рака биологов и биофизиков, заинтересованных в механочувствительных поведения, причас…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA