Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Summary

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Abstract

Die mechanische Mikro wurde gezeigt, als entscheidender Regulator der Tumorwachstumsverhalten und die Signalisierung, die selbst umgebaut wird und als Teil eines Satzes von komplexen, zwei-Wege mechanosensitive Wechselwirkungen modifiziert handeln. Während die Entwicklung von biologisch relevanten 3D-Tumormodellen haben mechanistische Studien über die Auswirkungen der Matrix Rheologie auf das Tumorwachstum erleichtert die inverse Problem der Zuordnung Veränderungen in der mechanischen Umgebung von Tumoren induziert bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir die Umsetzung der Partikel-Tracking Mikrorheologie (PTM) in Verbindung mit 3D-Modellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs als Teil eines robusten und brauchbarer Ansatz zur Längs Überwachung physikalischer Veränderungen in der Tumor-Mikroumgebung, in situ. Die hier beschriebene Methodik integriert ein System zur Herstellung von 3D-Modellen in vitro in einem Modell der extrazellulären Matrix (ECM) Gerüst aus Typ I-Kollagen eingebettet mit fluoreszenzmarkierten Sonden für gleichmäßig verteilte position-und zeitabhängigen Messungen Mikrorheologie gesamten Probe. In vitro Tumoren werden plattiert und parallel Bedingungen mit Multiwellfolien untersucht. Gestützt auf etablierte Verfahren, sind Videos von Tracer-Sonde Bewegungen über das Generalized Stokes Einstein Beziehung (GSER), um die komplexen frequenzabhängigen viskoelastischen Schermodul G * (ω) berichten umgewandelt. Da dieser Ansatz Imaging-basierte, wird die mechanische Charakterisierung auch auf große Durchlichtraum Feldern zugeordnet, gleichzeitig berichten qualitative Veränderungen in 3D Tumorgröße und Phänotyp. Repräsentative Ergebnisse zeigen, kontras mechanische Reaktion in Teilbereichen mit lokalisierten Invasion-induzierte Matrixabbau sowie System-Kalibrierung, Validierung werden Daten vorgestellt. Unerwünschte Ergebnisse aus gemeinsamen experimentelle Fehler und Problemlösungen dieser Fragen werden ebenfalls vorgestellt. Die 96-Well-Format 3D-Beschichtung Kultur in diesem Protokoll implementiert ist, ist conducive zu Korrelation von Mikrorheologie Messungen mit therapeutischen Screening-Tests oder der molekularen Bildgebung, neue Einblicke in die Auswirkungen der Behandlungen oder biochemische Reize auf die mechanische Mikroumgebung zu gewinnen.

Introduction

Es ist klar, von einer wachsenden Zahl von Hinweisen in der Literatur, dass Krebszellen, wie bei nicht-malignen Säuger Epithelzellen, reagieren sehr sensibel auf die mechanischen und biophysikalischen Eigenschaften der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) und andere Mikrokomponenten ^9.1. Elegante mechanistische Studien Einblicke in die Rolle der extrazellulären Steifigkeit als eine komplexe Signal mechanosensitive Partner, der malignen Wachstumsverhalten und Morphogenese ^2,3,10,11 reguliert ist. Diese Arbeit wurde insbesondere durch die Entwicklung von 3D in vitro-Tumormodellen, die biologisch relevante wiederherzustellen Gewebearchitektur und können in Trägermaterialien mit maßgeschneiderten Mechanik angebaut und durch optische Mikroskopie ^12-19 abgebildet werden erleichtert. Jedoch ist die andere Seite dieser mechanoregulatory Dialog zwischen Tumor und Mikroumgebung, durch die Krebszellen wiederum Veränderung der Fließeigenschaften ihrer Umgebung bleibt etwasschwieriger zu studieren. Zum Beispiel während der Invasion Prozesse, die Zellen am Rande eines Tumors kann epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und erhöhen die Expression von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die lokalen Abbau von ECM ^20-22, die wiederum Einfluss auf mechanosensitive Wachstumsverhalten führen andere proximalen Tumorzellen. Durch eine Vielzahl von biochemischen Prozessen, die Krebszellen die lokale Steifigkeit ihrer Umgebung wählen ständig auf und ab, um verschiedene Prozesse zu unterschiedlichen Zeiten anpassen. Die hier beschriebene Methode ist durch die Notwendigkeit für analytische Werkzeuge, die lokale Veränderungen in der Steifigkeit und Nachgiebigkeit der ECM während des Wachstums, die mit 3D-Tumormodellen integriert ist und in Längsrichtung mit biochemischen und phänotypische Veränderungen korreliert ohne Beendigung der Kultur werden kann berichten motiviert.

Auf der Suche nach einem geeigneten Verfahren in diesem Kontext zu implementieren, tritt Partikelverfolgungs Mikrorheologie (PTM) als starke Kandidaten.Diese Methode, die ursprünglich von Pionier Mason und Weitz ^23,24 nutzt die Bewegung der Tracer-Sonden in einem komplexen Fluid eingebettet sind, um die frequenzabhängige komplexe viskoelastische Schermodul G * (ω) in Mikron Längenskalen zu melden. Dieser allgemeine Ansatz wurde mit mehreren Varianten für unterschiedliche Anwendungen in weichen kondensierten Materie, Kolloide, Biophysik und Polymerphysik ^25-31 geeignet entwickelt. PTM hat gewisse Vorteile gegenüber anderen Methoden, da die Messwerte von lokalen Viskoelastizität durch zerstörungsfreie Videoabbildungs ​​biochemisch inaktive Tracer-Sonden, die zum Zeitpunkt der Kulturansatz aufgenommen werden und bleiben an Ort und Stelle über einen längeren Zeitraum des Wachstums bereitgestellt. Dies steht im Gegensatz zu Gold Standardmessungen mit einer oszillierenden Schergroß Rheometer, was notwendigerweise erfordert Beendigung der Kultur und meldet den Groß makroskopischen Rheologie der Probe statt Punktmessungen innerhalb der komplexen 3D Tumor microenvironment. In der Tat eine Reihe von Studien haben den Nutzen der Interpretation von Messungen der Sonde Tracer Bewegungen in oder rund um Krebs oder Nicht-Krebs-Zellen, um Verformungen der Zellmigration ^32, mechanische Beanspruchung von einem expandierenden Sphäroid ^33, intrazelluläre Rheologie ^34,35 induziert zu bemessen dargestellt und mechanische Spannungen und Dehnungen in Geweben entwickelt ^36, und die Beziehung zwischen Porengröße und Invasion Geschwindigkeit ³⁷ zuzuordnen. Andere Techniken für Mikrorheologie wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) implementiert werden kann, sondern in erster Linie zur Untersuchung von Punkten auf der Oberfläche der Probe und kann auch Kultur Sterilität, die Längs Messungen erschweren ³⁸ darstellen.

Hier ein umfassendes Protokoll umfasst Methoden für das Wachstum der 3D Tumorsphäroide geeignet für den Transfer in ECM mit eingebetteten Fluoreszenzsonden für Video-Partikel-Tracking-und Analyse-Methoden für die zuverlässige Abbildung räumlicher beschreiben wirVeränderungen im Laufe der Zeit Mikrorheologie in der Kultur. In der vorliegenden Implementierung werden 3D-Tumormodellen in Multiwell-Format mit Blick auf Einbau von Mikrorheologie Messungen mit anderen traditionellen Tests (zB Zytotoxizität), die dieses Format ist förderlich für gewachsen. In dieser repräsentativen Darstellung dieser Methodik wir Kultur in vitro 3D-Sphäroiden mit PANC-1-Zellen, eine etablierte Pankreaskrebszelllinie bekannt, Sphäroiden ^39, sondern alle hier beschriebenen Messungen bilden, sind breit anwendbar zu studieren, von soliden Tumoren mit einer Vielzahl von Zelllinien geeignet für 3D-Kultur. Da diese Methode von Natur-basierte Bildgebung ist es ideal für Co-Registrierung von hochauflösenden Mikrorheologie Daten mit großen Durchlicht-Sichtfelder, die Veränderungen in der Zellwachstum, Migration und Phänotyp berichten geeignet. Die Umsetzung der PTM integrierten Durchlichtmikroskopie auf diese Weise davon ausgegangen, reproduzierbare Positionierung der Mikroskoptisch whICH ist auf motorisierte kommerzielle Weitfeld-Epifluoreszenz biologische Mikroskope der Regel zur Verfügung. Die folgende entwickeltes Protokoll kann mit jedem vernünftig ausgestattet automatisierten Fluoreszenzmikroskop biologischen umgesetzt werden. Dies ist ein von Natur aus datenintensive Methode, die Übernahme von Gigabyte an digitalen Videomikroskopie für die Offline-Verarbeitung erfordert.

In dem folgenden Protokoll, Protokoll 1 bezieht sich auf die anfängliche Herstellung von Tumor-Spheroide, die hier mit Überlagerung auf Agarose beschrieben, konnte aber mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie hängenden Tropfen ⁴⁰ oder Rotationskultur ⁴¹ Techniken ersetzt werden. Protokoll 2 beschreibt den Prozess der Einbettung Sphäroiden in einer Kollagengerüst, obwohl alternativ könnte in vitro 3D Tumoren durch Einkapselung oder Einbettung von resuspendierten Zellen in ECM ^12,15, anstatt einzelne vorgeformte nichthaft Sphäroide gezüchtet werden. Nachfolgende Protokolle beschreiben Verfahren zur obtaining zeitaufgelöste Messungen Mikrorheologie durch Erfassen und Verarbeiten von Videomikroskopiedaten. Die Datenverarbeitung wird mit MATLAB, die Nutzung von Open-Source-Routinen für PTM auf Algorithmen ursprünglich von Crocker und Grier ^42, die auch ausgiebig für verschiedene Software-Plattformen entwickelt, gebaut beschrieben (siehe http://www.physics.emory.edu/ beschrieben ~ Wochen / IDL /).

Protocol

1. Kultivierung Tumorsphäroide Mischungs 10 ml Zellkultur-Wasser mit 0,1 g Agarose, um ein 1% Agarose-Lösung erhalten. Wärme Agarose-Lösung auf über 70 ° C (etwa 14 sec in einer Standard Mikrowelle oder durch Verwendung einer Heizplatte) vor dem Aliquotieren von 40 &mgr; l Agarose-Lösung in eine Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen. Inkubieren Platte bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde bei der Ernte-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken. Verwenden e…

Representative Results

Um die Gültigkeit von G * (ω)-Messungen an lokalisierten Positionen in einem komplexen Modell Tumor-Mikroumgebung zu verifizieren, wurden zwei erste Validierungsexperimente durchgeführt. Zuerst haben wir versucht, unsere Messungen gegen den "Goldstandard" der Groß oszillierende Scher rheometry validieren. Wir stellten identische Proben von Kollagenmatrix (ohne Zellen) in einer Konzentration von 1,0 mg / ml Kollagen. Diese Proben wurden mit einer Schütt Rheometers (TA Instruments AR-G2, unter Verw…

Discussion

In diesem Protokoll führen wir eine robuste und breit anwendbare Strategie für längs Tracking lokale Änderungen in ECM Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Wir stellen uns vor, dass diese Methodik könnte durch Krebs Biologen und Biophysiker interessiert mechanosensitive Verhalten in Matrixumbau bei Tumorwachstum und Invasion Prozesse verwickelt angenommen werden. Präzise Quantifizierung der Matrix Abbaukinetik kann besonders für diejenigen, die Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen, Lysyloxidase ode…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA