Longitudinal Måling af ekstracellulær matrix Stivhed i 3D tumormodeller med Partikel-tracking Microrheology

Summary

Partikel-tracking microrheology kan anvendes til ikke-destruktivt kvantificere og rumlig kortlægning af ændringer i ekstracellulær matrix mekaniske egenskaber i 3D tumormodeller.

Abstract

Den mekaniske mikromiljø har vist sig at fungere som en afgørende regulator af tumorvækst adfærd og signaler, som selv ombygget og ændret som en del af et sæt af komplekse, to-vejs mekanosensitive interaktioner. Mens udviklingen af ​​biologisk relevante 3D tumormodeller har lettet mekanistiske undersøgelser om virkningen af ​​matrix reologi på tumorvækst, det inverse problem med kortlægning ændringer i det mekaniske miljø induceret af tumorer er stadig udfordrende. Her beskriver vi implementeringen af partikel-tracking microrheology (PTM), sammenholdt med 3D-modeller af kræft i bugspytkirtlen som en del af en robust og levedygtig metode til længderetningen overvåge fysiske ændringer i tumor mikromiljø, in situ. Den her beskrevne metode integrerer et system forberede in vitro 3D-modeller indlejret i en model ekstracellulære matrix (ECM) stillads af type I kollagen med fluorescens-mærkede prober jævnt fordelt til position-og tidsafhængige microrheology målingerne i hele prøven. In vitro tumorer forgyldt og undersøgt i parallelle forhold ved hjælp multibrønds imaging plader. Tegning på etablerede metoder, er videoer af tracer probe bevægelser forvandlet via den generelle Stokes Einstein Relation (GSER) for at rapportere det komplekse frekvensafhængig viskoelastiske forskydningsmodul, G * (ω). Fordi denne tilgang er imaging-baseret, er mekanisk karakterisering også kortlagt på store transmitteret lys rumlige felter samtidig rapportere kvalitative ændringer i 3D tumor størrelse og fænotype. Repræsentative resultater, der viser kontrasterende mekanisk reaktion i delregioner forbundet med lokaliseret invasion-induceret matrixnedbrydning samt system kalibrering, er datavalidering præsenteres. Uønskede resultater fra almindelige eksperimentelle fejl og fejlfinding af disse spørgsmål er også præsenteret. 96-brønds 3D kultur plating format implementeret i denne protokol er conducive til korrelation af microrheology målinger med terapeutiske screeningassays eller molekylær billeddannelse til at få ny indsigt i virkningen af ​​behandlinger eller biokemiske stimuli på den mekaniske mikromiljø.

Introduction

Det fremgår af en voksende mængde af beviser i litteraturen, at kræftceller, som med ikke-maligne pattedyr epitelceller, er meget følsomme over for de mekaniske og biofysiske egenskaber af den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) og andre microenvironment komponenter ^1-9. Elegant mekanistiske undersøgelser har givet indsigt i den rolle ekstracellulære stivhed som et komplekst mekanosensitive signalering partner, der regulerer ondartet vækst adfærd og morfogenese ^2,3,10,11. Dette arbejde er blevet lettet navnlig ved udviklingen af 3D i vitro tumormodeller som genopretter biologisk relevant væv arkitektur og kan dyrkes i stillads materialer med afstemmelige mekanik og filmede ved optisk mikroskopi ^12-19. Men den anden side af denne mechanoregulatory dialog mellem tumor og mikromiljø, hvorigennem kræftceller gengæld ændre rheologien af ​​deres omgivelser, stadig nogetvanskeligere at studere. For eksempel under invasion processer celler i periferien af en tumor kan undergå epitelial til mesenkymale overgang (EMT), og forøge ekspression af matrix-metalloproteaser (MMP'er), der forårsager lokal nedbrydning af ECM ^20-22, hvilket igen påvirker mekanosensitive vækst adfærd andre proximale tumorceller. Gennem en række af biokemiske processer, cancerceller løbende ringe lokal stivhed af deres miljø op og ned for at passe til forskellige processer på forskellige tidspunkter. Den her beskrevne metode er motiveret af behovet for analytiske værktøjer, der rapporterer lokale ændringer i stivhed og overholdelse af ECM under væksten, der kan integreres med 3D tumormodeller og korrelerede langs med biokemiske og fænotypiske ændringer uden at afslutte kulturen.

På jagt efter en passende teknik til at gennemføre i denne sammenhæng, partikel-sporing microrheology (PTM) fremstår som en stærk kandidat.Denne metode, pioner oprindeligt af Mason og Weitz ^23,24 bruger bevægelsen af sporstof sonder indlejret i en kompleks væske at rapportere frekvensafhængige komplekse viskoelastiske forskydningsmodul, G * (ω) ved micron længdeskalaer. Denne generelle fremgangsmåde er blevet udviklet med flere variationer egnet til forskellige applikationer i bløde faststoffysik, kolloider, biofysik og polymer fysik ^25-31. PTM har visse fordele i forhold til andre metoder, da udlæsninger af lokal viskoelasticitet leveres af ikke-destruktiv video billeddannelse af biokemisk inaktive tracer sonder, der er indarbejdet på tidspunktet for forberedelse kultur og forblive på plads over længere perioder vækst. Dette er i modsætning til guld standard målinger med en oscillatorisk forskydning bulk-rheometer, hvilket nødvendigvis kræver ophør af kultur og rapporter hovedparten makroskopiske rheologi prøven snarere end punktmålinger inden komplekset 3D tumor microenvirjøet. Faktisk en række undersøgelser har vist nytten af fortolkningen målinger af sporstof probe bevægelser i eller omkring cancer eller ikke-cancerceller til at måle deformationer forbundet med cellemigrering ^32, mekanisk stress induceret af en ekspanderende sfæroid ³³ intracellulær rheologi ^34,35 og at kortlægge mekaniske belastninger i manipuleret væv ^36, og forholdet mellem porestørrelse og invasion hastighed ^37. Andre teknikker er egnede til microrheology, såsom atomic force mikroskopi (AFM) kan gennemføres, men primært til sondering punkter på prøvens overflade, og også kan udgøre kultur sterilitet problemer, der komplicerer langsgående målinger ^38..

Her beskriver vi en omfattende protokol omfatter metoder til vækst af 3D tumor spheroids egnet til overførsel til ECM med indlejret fluorescerende prober til video partikel-sporing og analysemetoder for pålidelig kortlægning rumligeændringer i microrheology over tid i kultur. I den nuværende implementering, er 3D tumormodeller dyrket i flere brønde format med udsigt til inkorporering af microrheology målinger med andre traditionelle assays (fx cytotoksicitet), som dette format er befordrende for. I dette repræsentative illustration af denne metode vi kultur in vitro 3D sfæroider ved hjælp PANC-1-celler, en etableret bugspytkirtelkræft cellelinie kendt for at danne sfæroider ^39, men alle målinger, der er beskrevet heri, er bredt anvendelige til at studere af faste tumorer ved anvendelse af en række forskellige cellelinjer egnet til 3D-kultur. Fordi denne metode er i sagens natur imaging-baserede det er velegnet til co-registrering af høj opløsning microrheology data med store transmitteret lys synsfelter, der rapporterer ændringer i cellevækst, migration og fænotype. Gennemførelsen af ​​PTM integreret med transmitteret lysmikroskopi på denne måde antager reproducerbar positionering af mikroskopbordet whICH er typisk tilgængelig på motoriserede kommerciel Widefield epifluorescens biologiske mikroskoper. Den protokol udviklet nedenfor kan implementeres med en hvilken som helst rimelighed udstyret automatiseret fluorescens biologisk mikroskop. Dette er en iboende data-intensive metode, som kræver erhvervelse af gigabytes af digitale video mikroskopi data for offline forarbejdning.

I den følgende protokol, protokol 1 vedrører den indledende behandling af tumor sfæroider, som er beskrevet her ved hjælp af overlay på agarose, men kan erstattes med en række andre metoder såsom hængende dråbe ⁴⁰ eller roterende kultur ⁴¹ teknikker. Protokol nr. 2 beskriver processen med at indlejre spheroids i en collagen stillads dog alternativt kunne in vitro 3D tumorer dyrkes ved indkapsling eller indlejring af resuspenderede celler i ECM ^12,15, snarere end enkelte præ-dannede ikke-klæbende sphæroider. Efterfølgende protokoller beskriver procedurer for obtaining tidsopløste microrheology målinger ved at erhverve og bearbejde video mikroskopi data, hhv. Databehandling er beskrevet ved hjælp af MATLAB, gør brug af open source-rutiner for PTM bygget på algoritmer oprindeligt beskrevet af Crocker og Grier ^42, som også er blevet udførligt udviklet til forskellige software-platforme (se http://www.physics.emory.edu/ ~ uger / IDL /).

Protocol

1.. Dyrkning Tumor Spheroids Bland 10 ml cellekultur kvalitet vand med 0,1 g agarose til opnåelse af en 1% agarose-opløsning. Heat agaroseopløsning til over 70 ° C (ca. 14 sekunder i en standard mikrobølgeovn eller ved hjælp af en varmeplade), før der afmåles 40 pi agaroseopløsning i en brønd på en 96-brønds plade. Inkubér pladen ved 37 ° C i mindst 1 time, mens høst celler under anvendelse af standardteknikker. Brug et hæmacytometer til bestemmelse af koncentrati…

Representative Results

For at verificere gyldigheden af G * (ω) målinger på lokaliserede positioner inden en kompleks model tumor mikromiljø, blev to indledende validering eksperimenter udført. Først, vi forsøgt at validere vores målinger mod "gold standard" af bulk oscillerende shear rheometry. Vi forberedt identiske prøver af collagenmatrix (uden celler) ved en koncentration på 1,0 mg / ml collagen. Disse prøver blev undersøgt med en bulk rheometer (TA Instruments AR-G2, ved hjælp af 40 mm parallel plade geom…

Discussion

I denne protokol introducerer vi et robust og bredt anvendelig strategi for langsgående sporing lokale ændringer i ECM stivhed i 3D tumormodeller. Vi forestiller, at denne metode vil kunne vedtages med kræft biologer og biophysicists interesseret i mekanosensitive adfærd impliceret i matrix remodellering under tumorvækst og invasion processer. Præcis kvantificering af matrix nedbrydningskinetik vil være særlig værdifuldt for dem, der studerer aktiviteten af ​​matrixmetalloproteaser, lysyloxidase eller andre…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA