O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

Summary

Descrevemos aqui métodos simples para a preparação de vesículas, o encapsulamento de transcrição e maquinaria de tradução, e o controlo da produção da proteína. Os sistemas isentos de células resultante pode ser utilizado como um ponto de partida para a construção de imitadores celulares cada vez mais complexas.

Abstract

Como mudanças de juros a partir de moléculas individuais para sistemas de moléculas, um número crescente de laboratórios têm procurado construir de baixo para cima imita celulares que melhor representam a complexidade da vida celular. Até à data, há uma série de caminhos que podem ser tomados para construir imita celulares compartimentadas, incluindo a exploração de emulsões de água em óleo, os dispositivos microfluidicos e vesículas. Cada uma das opções disponíveis tem vantagens e desvantagens específicas. Por exemplo, as emulsões de água em óleo, dar alta eficiência da encapsulação, mas não se imitam assim a barreira da permeabilidade das células vivas. A principal vantagem dos métodos aqui descritos é que todos eles são fácil e barata de implementar. Maquinaria de transcrição-tradução é encapsulado no interior de vesículas fosfolipídicas através de um processo que explora instrumentação comum, tal como um evaporador centrífugo e uma extrusora. As reacções são monitorizadas por espectroscopia de fluorescência. O protocolos pode ser adaptado para a expressão de proteínas recombinantes, a construção de imita celulares, a exploração dos requisitos mínimos para a vida celular, ou a montagem de um circuito genético.

Introduction

Livre de células, in vitro reações de transcrição, tradução e geração de vesículas de lipídios sintéticos não são novidade. No entanto, a combinação dos dois para um mímico celular é significativamente mais challenging1-6. E. coli extractos celulares com ou sem T7 ARN polimerase pode ser usada como uma fonte de maquinaria de transcrição-tradução ^7,8. Os extractos celulares beneficiem da presença de componentes celulares adicionais que podem facilitar a expressão de proteínas e de dobragem. Alternativamente, uma mistura de ARN individualmente purificados e moléculas de proteína, ou seja, o sistema ⁹ puro, pode ser usado para mediar a síntese de proteínas intravesicular ^4,10-14. O sistema PURE permite a construção de imitadores celulares totalmente definidos e não sofrem da actividade de nuclease encontrada em extractos celulares. Praticamente, isto significa que muito menos do molde de ADN é necessária, facilitando assim os processos com baixa eficácia de encapsulação ¹¹ </sup>. Embora menos freqüentemente usados, imita celulares pode ser construído com extratos de células derivadas de eucariótica cells15. Até o momento, cascatas encapsulados geneticamente codificados e imita celulares que detectam o meio ambiente têm sido relatados ^16-18.

A maneira mais simples para monitorar reações de transcrição-tradução é medir a fluorescência ou luminescência de elementos geneticamente codificados. Tipicamente, a luciferase do pirilampo ou GFP ¹⁹ são usados, embora in vitro reacções são frequentemente medida por marcação radioactiva. Detecção de fluorescência, além disso permite a monitorização das populações de vesículas ^20,21 através de métodos baseados em citometria, oferecendo alguns insights sobre a natureza estocástica dos processos biológicos semelhantes. Estes métodos de monitorização têm sido utilizadas para definir um pequeno conjunto de regras de design e de uma biblioteca de peças de partida para construir, incluindo um conjunto de proteínas fluorescentes que são compatíveis com in vitro de transcrição-tradução ^22, a influência da organização genética sobre a expressão ^22, a actividade de factores sigma ^16, e a eficiência de terminadores da transcrição ^23. No entanto, ainda há muito que precisa ser feito para aumentar a capacidade de construir previsível, in vitro, os dispositivos geneticamente codificados.

Existem vários métodos disponíveis para fazer vesículas. Os métodos mais comuns dependem da geração de uma película lipídica fina sobre uma superfície de vidro, seguido por ressuspensão em meio aquoso solution24. Se a solução aquosa contém maquinaria de transcrição-tradução, por exemplo, então uma fracção das vesículas formadas iria conter os componentes necessários para a produção de proteína. No entanto, a eficiência de encapsulação de tais métodos é baixo, o que significa que somente uma pequena percentagem de vesículas são activas. Muitos dos métodos alternativos caracteriza-se por muito mais ef encapsulamentoiciency explorar a conversão de gotículas de emulsão de óleo-em-água para vesículas. Embora seja provável que tais métodos serão comuns no futuro, actualmente estes métodos sofrem da necessidade de equipamento especializado para dar vesículas com as composições de membrana alteradas ^25. Uma vantagem distinta de óleo-em-água para métodos de vesículas é o potencial para controlar lamelaridade membrana. O método aqui descrito baseia-se no protocolo de película fina de lípidos descrito pelo laboratório Yomo ¹¹ com ligeiras modificações, incluindo um passo de homogeneização adicional. Este método é simples, barato, e dá vesículas sólidas bem adequado para o encapsulamento da maquinaria de transcrição-tradução.

Protocol

1. Preparando o Modelo de DNA Purifica-se o plasmídeo a partir de uma estirpe de laboratório padrão de E. coli, tais como E. coli DH5a ou Nova azul com um kit comercial. Em alternativa, um produto de PCR linear pode ser purificado de forma semelhante com um kit comercial. Eluir o DNA apenas com H 2 O. Fenol-clorofórmio extrair a solução de ADN 26. Determinar a concentração de DNA e da pureza, por exemplo, por absorção de UV ou outros métodos adequados. É importante a utilização de ADN altamente puro para a eficiente transcrição-tradução. 2. Preparando o Fina Lipid Film Pesa-se o pó de lípido seco e dissolver em solventes. Para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), as soluções de reserva são preparadas em clorofórmio a uma concentração de 40 mg / ml. Nota: Os solventes orgânicos devem sempre ser manuseados com pipetas de vidro e garrafas. Em outras palavras, o plástico não tem de ser usado. Loja ssoluções tock no ar apertados, garrafas de vidro âmbar resistentes a solventes a -20 ° C, de preferência sob argônio. Alíquotas de 12 umol a POPC (220 ul de 40 mg / ml de solução) para um balão de fundo redondo de 5 ml. Evapora-se o solvente com um evaporador rotativo (Figura 1) para gerar a película lipídica fina. Fixar firmemente a balão de fundo redondo ao tubo de alimentação com um grampo circular e iniciar a rotação do frasco. Iniciar a circulação de água através da serpentina de condensador. Usando um banho de calor não é necessária, porque clorofórmio tem um baixo ponto de ebulição de 61,2 ° C à pressão atmosférica normal. Assegure-se que o sistema é aberto para a atmosfera através da verificação de que a torneira é aberta. Ligar a bomba de vácuo e, lentamente, fechar a torneira de passagem para aplicação do vácuo ao sistema. Uma fina película de lípido é depositado nas paredes do balão de fundo redondo, durante a evaporação rotativa, formando uma película opacaque é visível a olho nu. Deixe o evaporador rotativo continuar por 0,5-2 horas. Para parar o processo, liberam lentamente a pressão de vácuo, parar a rotação, e retirar o balão de fundo redondo. 3. Ressuspensão de lipídios e homogeneização Vesicle Adicionar 1 ml de 18,2 mohms H2O à película lipídica fina directamente no balão de fundo redondo. Vortex vigorosamente a solução a uma velocidade máxima, cerca de 3.200 rpm, até que o filme de lípidos destaca a partir do vidro, que é observável a olho nu. Transferir a solução de lípidos num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Definir-se um anel de estar a realizar um homogeneizador com uma ponta de 5 mm. Coloque um suporte microcentrífuga abaixo do homogeneizador para prender firmemente a dispersão de lípidos. Lavar o elemento de dispersão do homogeneizador por imersão da ponta em 18,2 mohms H2O e correr durante alguns segundos. Colocar o elemento de dispersão directamente na dispersão de lípidos assegurando thna ponta não toca o fundo do tubo de microcentrífuga. Homogeneizar durante 1 min no nível de potência 4 ou 14.000 rpm. 4. Extrusão vesícula e liofilização Montar as partes do mini-extrusor (Figura 2), que consiste num invólucro exterior e uma porca de fixação que abriga dois membrana de Teflon interno suporta, dois O-rings, e um rolamento de Teflon. Colocar os dois O-rings nos sulcos dos suportes de membranas internas. Prewet dois filtros e uma membrana de 400 nm. Os filtros vai ser colocado contra a Teflon dentro de os anéis de vedação com a membrana entre elas. Colocar a membrana de suporte dentro do invólucro exterior da extrusora com a membrana rodeado por dois filtros em entre os anéis de vedação. Coloque o mancal de teflon dentro da caixa e coloque a porca de fixação e aperte com a mão. Lavar duas seringas e preencha um com 18,2 mohms água. Insira as agulhas de seringa na pequena holes do teflon em cada extremidade da montagem de extrusão. As agulhas devem deslizar facilmente, não force as agulhas. Prenda a extrusora com as seringas na extrusora habitação e prender. Passar a água através do extrusor, empurrando lentamente a água para fora da seringa e para o outro. Isso representa uma passagem. Repita o procedimento para um total de três passagens, garantindo que não haja vazamentos presentes. Retire a seringa de água e descarte a água. Encher uma seringa com a amostra, atribuem à extrusora, e lentamente passar a solução através da membrana das vesículas, como descrito acima no passo 4.3. Repita a 10x para um total de 11 passagens. Conforme o processo de extrusão prossegue, a amostra irá tornar-se menos turva e mais fácil empurrar através da membrana. Uma queda súbita na resistência, no entanto, geralmente indica uma ruptura da membrana. Transferir a solução de vesículas extrudidas e fazer 40 mL alíquotas das vesículas em tubos de microcentrífuga.Flash congelar cada alíquota em gelo seco ou em nitrogênio líquido. Liofiliza-se cada alíquota com um evaporador centrífugo durante a noite a 30 ° C. Armazenar as vesículas vazias liofilizadas a -20 ° C. 5. Encapsular maquinaria de transcrição-tradução Misture os componentes da reacção de transcrição-tradução e adicionar 20 unidades de inibidor de RNase. Incubar em gelo. Adicionar o molde de ADN. Para obter uma reacção de controlo, 250 ng de um plasmídeo mVenus codificando uma proteína fluorescente ou semelhante por trás de um promotor de transcrição de T7 e um forte E. coli local de ligação ao ribossoma é recomendada. Levar o volume final de 25 ul com água sem RNase. Hidrato de uma alíquota de vesículas liofilizados (a partir do passo 4.6) com 10 ul da reacção montados no passo 5.3. Vortex brevemente a mistura até que as vesículas são ressuspensas. Isso deve levar menos de 30 segundos. Incubar a reação em gelo por 30 min para permitir que as vesículas a inchar. Dilui-se a mistura de vesículas de 20 vezes para um volume final de 30 ul pela adição de 1,5 ul de vesículas em 27,0 ul de 50 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,4 e 1,5 mL de 20,2 mg / ml de Proteinase K. A DNase e RNase Também podem ser adicionados neste ponto como uma alternativa para a proteinase K para degradar o material extravesicular. Incubar durante pelo menos 2,5 horas a 37 ° C. 6. Microscopia Examine as vesículas eo progresso da produção de proteína fluorescente em diferentes pontos do tempo. As vesículas que têm um diâmetro maior do que os 400 nm de tamanho de poro da membrana utilizada para a extrusão das vesículas. Prepara-se uma câmara de medição, colocando um 20 x 5 mm espaçador de silício sobre uma lâmina de microscópio padrão. Pipetar 10 ul de vesículas para a câmara de amostragem. Coloque uma tampa de vidro siliconizada deslizamento sobre a câmara. Observe as vesículas com um 63X dispersão de óleo or objectivo semelhante por microscopia de campo brilhante e fluorescência, usando o conjunto de filtro apropriado para a proteína fluorescente explorada.

Representative Results

A microscopia de fluorescência revelou que a fluorescência é observado apenas no interior das vesículas, porque o material extravesicular é enzimaticamente degradada (Figura 3). Para a expressão de mVenus, intravesicular fluorescência começa a ser observada após 1,5 horas, a 37 ° C e atinge máxima intensidade de fluorescência dentro de 6 horas. A temperatura óptima e o tempo de incubação pode variar de acordo com as construções específicas utilizadas. Por exemplo, proteínas fluorescentes diferentes amadurecer bastante diferente de uma forma dependente da temperatura. Em outras palavras, a observação da produção de proteínas não é unicamente dependente da síntese de proteínas e de dobragem, mas também sobre a formação de cromóforos. Síntese geral de proteína pode ser aumentado por incorporação de poros de proteína de membrana para permitir um fluxo de componentes empobrecido necessários para a transcrição e tradução 27. Recomenda-se a realização de um análogo de transcrição-traduçãoção de reacção, na ausência de vesículas para assegurar que a construção genética é explorado funcional. Esta reacção de controlo, é mais facilmente monitorizados por espectroscopia de fluorescência, em vez de microscopia. Figura 4 mostra uma reacção de transcrição in vitro de translação de um construto mVenus codificação. Reações unencapsulated dar muito maior total de intensidades de fluorescência do que reações intravesicular semelhantes. Isto é devido à eficiência de encapsulação e porque o volume total intravesicular é muito menos do que o volume extravesicular (isto é, um efeito de diluição). Figura 1. O evaporador rotativo e bomba de vácuo. Clique aqui para ver a imagem ampliada . <p class="jove_content"fo: manter-together.within-page = "always"> Figura 2. A carcaça e as partes da máquina de extrusão são mostradas separadamente. Da esquerda para a direita, seringa, porca de fixação, rolamentos de teflon, a membrana interna suporta com negros anéis que enfrentam um ao outro, extrusora de revestimento externo, e segundo seringas. Clique aqui para ver a imagem ampliada . Figura 3. Imagens de fluorescência de produção de proteína mVenus em lipossomas A e C:.. Imagens de campo claro de vesículas multilamelares depois de 1,5 horas e 2,5 horas e B &# 160; D: A produção de mVenus é visualizado por fluorescência (cor verde), após 1,5 e 2,5 horas, respectivamente. Barra de escala é de 20 mM. Clique aqui para ver a imagem ampliada . Figura 4. Na reacção de controlo não encapsulado in vitro de transcrição in vitro e tradução de mVenus. A intensidade de fluorescência foi medida a cada 5 minutos ao longo de 4 hr. Os dados foram obtidos com um instrumento de PCR em Tempo Real. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Embora a biologia sintética livre de células ainda está em sua infância, os avanços criaram uma base a partir da qual podem ser feitos sistemas de células, como cada vez mais complexas. A reconstituição da maquinaria de transcrição-tradução de totalmente definido componentes ⁹ dentro de vesículas ²⁸ foi particularmente significativo no sentido de facilitar os esforços posteriores na construção artificial ambientalmente sensível cells17 de 18. Da mesma forma, estudos de células artificiais têm sido usados ​​para investigar os processos evolutivos ^4,29,30, os detalhes mecanicistas de RNA e síntese protéica ^22,31, as influências de metabólica load32, 33, ea montagem de partículas virais ^34. É importante ressaltar que o conhecimento suficiente, agora que existe a função celular básico pode ser reconstituído no interior de vesículas no laboratório seguindo estes relatórios anteriores e os protocolos aqui descritos.

Para além de ser fácil, o encapsulamento de pr descritoocedure tem vários benefícios. Por exemplo, muitos vazios, aliquotas liofilizadas de vesículas pode ser feita antecipadamente e guardado a -20 ° C para uso posterior. O protocolo faz moléculas biológicas que não estão sujeitos a solventes orgânicos, as mudanças drásticas de temperatura, ou longos períodos de diálise. Espera-se que a suavidade do processo vai facilitar a incorporação de componentes adicionais, conforme necessário. Também não foram observados efeitos adversos para a alteração da composição lipídica da membrana sobre a eficiência de encapsulamento ou de transcrição-tradução. Assim, os lípidos mais propícia para a incorporação de proteínas de membrana, as morfologias específicos, ou de visualização poderão concebivelmente ser explorada.

A principal limitação do método descrito é que as vesículas resultantes não são homogéneas em tamanho ou lamelaridade. Para muitas aplicações, estas dificuldades não interferir com a interpretação dos dados. No entanto, caso seja necessário, os passos adicionais podem ser incorporados ao dia estreitoe distribuição de tamanhos e diminuir as camadas de membranas, tais como a novas rondas de extrusão, após o encapsulamento, congelação-descongelação, ou diálise ^35. Sem dúvida, melhores métodos que burlam estes e outros problemas serão desenvolvidas. Até então, encontramos o protocolo aqui descrito para ser bem adequado para a construção de imitadores celulares.

Materials

Quick Spin Mini-prep kit	Qiagen	27104
Spectrometer	NanoDrop 1000	NDB767ND
POPC	Avanti Polar Lipids	770557	MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6
Ethanol	Sigma Aldrich	459836	Anhydrous, >99.5%
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use	Sigma Aldrich	P3803-100mL	Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
Chloroform	Biotech Grade Fluka	496189-1L	Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer
Brown amber glass bottles	VWR	89043-518	55X 48 mm
Rotary evaporator	Buchi Rotovapor R-210/Sigma	Z563846EU-1EA	With jack and water bath, 29/32 joint 240 V
Analog vortex mixer	VWR	945300	Speed 1,000-3,200 rpm
Homogenizer	IKA T10 Basic Ultra-Turbax	3420000
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610020
Extruder filters	Whatman	610014	drain disc 10 mm
Extruder polycarbonate membrane 400 nm	Whatman	61007	nuclepore polycarbonate
Speed vacuum	Labconco	7970011	Centritrap DNA concentrator
PURExpress kit	New England Biolabs	NRM #E6800S
RNAse inhibitor (40,000 U/ml)	New England Biolabs	#M0307S
Proteinase K (20.2 mg/ml)	Fermentas	#EO0491
Microscope	Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera
RealTime	CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)
Silicon press to seal  -Molecular Probe	Life Technologies	P18174	Resistant from  -25-30 °C
Siliconized glass circle cover slides	Hampton Research	HR3-231	Diameter= 22 mm
ImageJ	NIH