حديثي الولادة حنوني التثقيب الكهربائي السطحية
Summary
سطح حنوني هي منطقة فريدة من نوعها السلف في الجهاز العصبي المركزي الذي يتلقى اهتماما متزايدا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة للتلاعب الجيني السريع في هذه المنطقة السلف باستخدام أسلوب التثقيب الكهربائي تعديلها. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيقات الخلوية والجزيئية الأنساب الخلية ومسارات الإشارات المشاركة في تمايز الخلايا واستجلاء مصير وخصائص الخلايا الوليدة.
Abstract
على مدى السنوات العديدة الماضية تم التعرف على سطح حنوني كما محراب جرثومي من أهمية خلال الجنينية، ما حول الولادة والكبار العصبية وgliogenesis، بما في ذلك بعد الاصابة. ومع ذلك، وأساليب للاستجواب وراثيا هؤلاء السكان السلف وتتبع الأنساب الخاصة بهم كان محدودا نظرا لعدم وجود خصوصية أو تستغرق وقتا طويلا إنتاج الفيروسات. وبالتالي، فقد كان التقدم في هذه المنطقة بطيئة نسبيا مع عدد قليل من التحقيقات في هذا الموقع. وقد استخدم التثقيب الكهربائي لأكثر من عقد لدراسة خصائص الخلايا الجذعية العصبية في الأجنة، ومؤخرا في الدماغ بعد الولادة. نحن هنا وصف تقنية فعالة وسريعة، وبسيطة للتلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني استنادا إلى نهج التثقيب الكهربائي تكييفها. حنوني التثقيب الكهربائي سطح يسمح لوضع العلامات الوراثية السطحية والتلاعب من هذه الأسلاف، وبالتالي تمثل منهجا لتوفير الوقت واقتصادية لدراسة هذه الخلايا.
Introduction
الخلايا الجذعية والسلف العصبية موجودة في جميع أنحاء الثدييات CNS 1، 2. طبيعة وخصائص في مناطق جرثومي الجنينية والكبار المحيطة المناطق البطين من الدماغ والحبل الشوكي التي تم توثيقها على نطاق واسع في العقد الماضي 1-3. في جزء كبير منه، وكان هذا نتيجة لتطور أدوات الجينية على نحو متزايد دقيقة، مثل الجهاز العصبي محددة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية الأليلات floxed أو النسب فيروسات تتبع 4. ومع ذلك، المنطقة سلف واحد الفحص الشامل لديه منطقة حنوني السلف السطح فقط في الآونة الأخيرة وصفها بأي قدر من التفصيل 5-7 وينتظر.
يتم تعريف سطح حنوني من الدماغ كواجهة بين سطح الدماغ والسحايا المحيطة 8. خلال التنمية، الظهارية العصبية و، في وقت لاحق، قدم نهاية شعاعي الدبقية نعلق على هذا السطح 9،10. بعض التنوبويلاحظ الخلايا العصبية في الدماغ الواحد والإنسان والعديد من mitoses الخلايا العصبية في هذه المنطقة 11. في وقت لاحق، خلال تكوين الخلايا العصبية الجنينية، ومن المعروف interneurons القشرية لاجتياز المنطقة حنوني، بالإضافة إلى طرق الهجرة في منطقة المتوسط ومنطقة subventricular 12-14. خلال هذه الفترة، والخلايا الجذعية يمكن تربيتها من هذه المنطقة، ويبدو أن يكون موقع نشط من العصبية وgliogenesis 5. في الدماغ الكبار، فقد أفيد أن interneurons يمكن أن يولد من الأسلاف سطح حنوني التالية التحدي ميتة 7. ومع ذلك، فقد ظلت مساهمة هذه المنطقة إلى بلده لgenensis أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة غامضا ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة تحديدا التحقيق في هذه المنطقة 6. في أكيمة متفوقة وفي القشرة الدماغية، قد interneurons سطحية (أو طبقة أنا في القشرة) تعدل دائرة الانتاج من السكان الكامنة الخلايا العصبية مثير، وبالتالي المساهمة significantly إلى وظيفة هذه الهياكل. على وجه الخصوص، طبقة 1 interneurons في موقف رئيس لتنظيم إطلاق الخلايا العصبية في جميع أنحاء الطبقات العليا من القشرة المخية نظرا التواصل فيما بينها واسعة إلى الطبقات السطحية والعميقة من الأعمدة القشرية 15،16. بطريقة مماثلة، وتلقي interneurons الأفقي المدخلات مثير من الألياف القشرية وشبكية العين، مشروع على مساحة واسعة نسبيا ويتم المضاربة للتوسط تثبيط السكان العصبية الاستجابة للمحفزات البصرية البعيدة 17،18. أيضا، مورفولوجيا بهم هو مناسبة تماما للعب دور محتمل في النشاط موجة منقوشة في النظام البصري النامية 19. ومن المثير للاهتمام، والتنمية عصبون والنضج يحدث إلى حد كبير بعد الولادة. علاوة على ذلك، تم العثور على هذه العملية النضج إلى أن ينظم نشاط الخلايا العصبية وبالتالي فهي ركيزة من اللدونة التنموية مع عواقب مدى الحياة على حلبة ظيفة 20،21. والجدير بالذكر أن نموصوفة س المروجين والتي يمكن أن تستهدف بشكل خاص هذه الخلايا transgenically. يمكن أن تستهدف تقسيم الأسلاف مع الارتجاعي 7 ولكن الإنتاج الفيروس هو مضيعة للوقت وتتطلب مهارة لانتاج التتر عالية اللازمة لتنبيغ الخلية.
وقد أدى التثقيب الكهربائي إلى نهضة في دراسة النمو العصبي لأنه يسمح للاستجواب الوراثية السريع والفعال للمسارات الإشارات العصبية في الأسلاف 4، 22، 23. التثقيب الكهربائي ينطوي على حقن الحمض النووي البلازميد، تليها إيصال النبضات الكهربائية إلى الخارج من الرأس، لدفع unidirectionally الحمض النووي في الأسلاف المتكاثرة المحيطة البطينين 4، 22، 23. يبدو التثقيب الكهربائي يتطلب العبور من الخلايا من خلال المرحلة M من دورة الخلية للتعبير عن الجينات المحورة البلازميد 24. على وجه التحديد، وقد وجد أن فقطوالخلايا التي تمر عبر مرحلة M في غضون 8 ساعة من التثقيب الكهربائي من البلازميدات التعبير عن الجينات المحورة على الرغم من التنفيذ الفعال لجميع الخلايا داخل ~ 160 ميكرون من جدار البطين 24. وتكهن بأن هذا يرجع إلى الحاجة إلى المغلف النووية انهيار في السماح للوصول النووية من البلازميدات episomal، والمواد الكيميائية التي تسبب permeabilization النووية يمكن أن تحفز التعبير عن البلازميدات في خلايا آخر الإنقسامية 25. يعملون أصلا في الجنين 22، تم تكييفها للاستخدام التثقيب الكهربائي في الدماغ ما بعد الولادة في وقت لاحق من ذلك بكثير 26، 27. في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت التثقيب الكهربائي لاستخدامها في التلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني 6. علاوة على ذلك، باستخدام هذا النهج أظهرنا أن هناك على ما يبدو اثنين الأنساب متميزة من الأسلاف في هذه المنطقة interneuronal ونجمي 6. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة، وقوية لاستهداف هذه الخلايا للاستجوابتطوير آليات تنظيم هذه الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجانب الأكثر أهمية ل electroporation ناجحة من الأسلاف سطح حنوني هي: 1) استهداف مزيج البلازميد إلى سطح حنوني؛ 2) تجنب توليد القيلة في موقع الحقن؛ و 3) تجنب الوفيات المرتبطة التثقيب الكهربائي الدماغ المتوسط.
تستهدف بشكل مناسب سطح حنوني يتم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من جائزة صموئيل Oschin الشامل منتدى معهد أبحاث السرطان السرطان فضلا عن أموال من معهد الطب التجديدي في سيناي، وغيران الأسرة. وأيد المشروع هو موضح في شكل كور قسيمة CTSI بتمويل من المركز الوطني للبحوث الموارد، منحة UL1RR033176، والآن في المركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم، منحة UL1TR000124. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
