Tissue Engineering af Tumor Stromal mikromiljø med Application til cancercelleinvasion

Summary

Manipuleret væv fibroblast-afledte native matrix er en ny værktøj til at generere en stromal substrat, som understøtter epitelcelleproliferation og differentiering. Her en protokol at anvende denne metode til at vurdere virkningerne af forskellige stromale celletyper på tumor cellebiologi præsenteres.

Abstract

3D organotypiske kulturer af epitelceller på en matrix indlejret med mesenchymale celler er almindeligt anvendt til at studere epitelial celledifferentiering og invasion. Rotte hale kollagen type I og / eller matrix afledt fra Engelbreth-Holm-Swarm muse sarcomaceller traditionelt er blevet anvendt som substrater til at modellere matrix eller stromale mikromiljø, hvori mesenchymale celler (sædvanligvis fibroblaster) er befolket. Selvom forsøg med sådanne matricer er meget informativ, kan det hævdes, at på grund af en mere tungtvejende tilstedeværelsen af ​​en enkelt protein (som i type I kollagen), eller et højt indhold af basalmembrankomponenter og vækstfaktorer (såsom i matrix stammer fra mus sarcomaceller), har disse substrater ikke bedst afspejler bidraget til matrixsammensætning fra stromacellerne selv. At studere indfødte matricer produceret af primær dermalfibroblaster isoleret fra patienter med en tumor udsat, genetisk blærer lidelse (recessive dystrofiskepidermolysis bullosa), har vi tilpasset en eksisterende native matrix protokol til at studere tumorcelleinvasion. Fibroblaster tilskyndet til at producere deres egen matrix over en længere periode i kultur. Denne native matrix derefter løsrevet fra dyrkningsskålen og epitelceller udsås på det før hele cokultur hæves til luft-væske-grænsefladen. Cellulær differentiering og / eller invasion kan derefter vurderes over tid. Denne teknik giver mulighed for at vurdere epitel-mesenchymale celle interaktioner i en 3D-indstilling uden behov for en syntetisk eller udenlandsk matrix med den eneste ulempe er den lange periode, der kræves for at producere den native matrix. Her beskrives anvendelsen af ​​denne teknik til at vurdere evnen af ​​et enkelt molekyle udtrykt af fibroblaster, type VII collagen, til at inhibere tumorcelleinvasion.

Introduction

Anvendelse af biomateriale i 3D vævskultur har gjort det muligt for forskerne at studere celle adfærd i laboratoriet under fysiologiske betingelser mere beslægtet med et in vivo-miljøet end én gentaget med 2D-adhæsion og et plastunderlag. Især fremad store fremskridt der er gjort i modellering lagdelt epiteler med vedtagelsen af 3D dyrkningsmetoder på luft-væske grænsefladen ^1-4. Sådanne teknikker trofast efterligner keratinocytdifferentiering og tumorcelleinvasion muliggør større fleksibilitet og troskab for forskere studerer disse processer. Valget af biomateriale substrat til at efterligne det stromale miljø har primært involveret anvendelse af type I collagen, Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix og de-epidermized dermis. For eksempel har cancerassocierede fibroblaster vist sig at bidrage mod cancer invasion ^5, initiering og progression via stromale-epitel interaktioner ^6,7 when dyrkes i sådanne substrater.

Den gyldne standard for at efterligne det stromale miljø i huden, de største og mest udbredte studerede stratificerede epitel ved hjælp af sådanne teknikker, anses for at være de-epidermized menneskelige dermis (DED). Udarbejdelse af DED omfatter fjernelse af overhuden via trypsinisering eller fysisk afstandtagen fra humant kadaverhud ^3,4. Dog kan adgang til en sådan hud være meget svært for laboratorierne ikke er associeret med kliniske institutioner, og syge dermis er nær umuligt at opnå. Som et alternativ, laboratorier ofte bruger en kombination af type I kollagen (isoleret fra rotte haler) og / eller Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix.

Efter opdagelsen i 1927 af Nageotte ⁸ at kollagen let kan isoleres under anvendelse af eddikesyre og saltudfældning, blev dets anvendelse på vævskultur senere udviklet af Huzella og kolleger ^9.. Kollagen overtræk viste sig at være overlegen i forhold til glas til cellekultur af 29 stammer og vævseksplantater som interrogerede af Ehrmann og Gey ^9. I øjeblikket er den største type af kollagen anvendes i vævskultur isoleret fra rotte-hale sener, og er normalt købt fra kommercielle kilder. Den ulempe til trofast substrat sammenfatning er imidlertid, at rotte hale kollagen er ikke identisk med human collagen, eller de humane dermis, hvor type I og III collagens er til stede som hovedbestanddele, og isolerede rotte hale kollagen er uvægerligt fragmenteret.

Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix er en gelatinøs proteinblanding udskilles af dyrkede Engelbreth-Holm-Swarm muse sarcomaceller ^10. De vigtigste bestanddele er laminin, type IV collagen, heparinsulfat proteoglycan entactin og nidogen og den nøjagtige mængde af disse proteiner vil variere fra batch til batch. Bortset fra strukturelle proproteiner, indeholder denne matrix også betydelige niveauer af vækstfaktorer, såsom transformerende vækstfaktor β, epidermal vækstfaktor, insulin-lignende vækst faktor 1, kvæg fibroblast-vækstfaktor, og trombocyt-afledt vækst faktor, som ville ændre cellulære adfærd ^11,12. Peger mod det store kompleksitet Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix, blev identificeret i alt 1.851 proteiner i en nylig proteom undersøgelse ^13. I lyset af de rige og komplekse karakter af denne matrix, er forsigtighed blevet rådgivet ved fortolkning og sammenligning af forskellige eksperimenter med brug af det ^11.

Vores laboratorier har en stor interesse i genetiske hudsygdomme, især dem med en disposition for at udvikle kutant planocellulært karcinom (CSCC) ^14.. I tilfælde af recessive dystrofisk epidermolysis bullosa (RDEB), en alvorlig blærer sygdom med germline mutationer i COL7A1-genet <sop> 15-17, har vi fastslået, at den dermale mikromiljø i disse patienter er tumorfremmende ^18. I løbet af denne undersøgelse, vi var ude af stand til at vurdere tumorfremmende egenskaber dermalfibroblaster indlejret i kollagen I / Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix og undersøgte metoder til vurdering cellernes egne, indfødte matrix. For at opnå dette, har vi ændret en tidligere teknik fra laboratoriet af Lucie Germain arbejder på menneskers hud ækvivalenter ^19,20. Germain teknik var i stand til at rekonstruere den menneskelige hud med velorganiseret basalmembran med primære humane keratinocytkulturer og fibroblastkulturer i mangel af en syntetisk eller cadaveric stillads.

I dette papir de trin, der anvendes til rekapitulere den kutane tumor stroma mikromiljø (native matrix) afledt direkte fra primære stromale fibroblaster in vitro beskrives ^18. Native matricer produced af langvarig kultur af fibroblaster blev anvendt som svarer til assay for CSCC celleinvasion dermal. Vi præsenterer data ved hjælp af indfødte matrix stammer fra enten den ekstracellulære matrix, der udskilles af RDEB fibroblaster (med mangelfuld typen VII kollagen (C7)) eller fra RDEB fibroblaster retrovirustransformerede transduceret med en type VII collagen udtrykker konstruere og demonstrere dybtgående effekt af en enkelt collagen på tumor celleinvasion.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen Principper og blev godkendt af de relevante etiske komitéer. 1.. Udarbejdelse af medier og reagenser Fremstilling af 200x af L-ascorbinsyre-2-phosphat-lager 29 mg L-ascorbinsyre 2-phosphat pr 5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) opløses og filtreres gennem 0,22 um membranfilter. Store som 0,25 ml sterile portioner i -20 ° C. Tilføj 0,25 ml alikvot af 200x L-ascorbinsyre 2-p…

Representative Results

Denne teknik åbner mulighed for at undersøge og sammenligne den invasive opførsel af tumorceller (i dette tilfælde CSCC) under forskellige 3D stromale miljøer. Ved hjælp af denne teknik, kan ikke blot C7-deficiente native matricer, gentaget den RDEB dermal miljø dannes, men også yderligere matricer, som er blevet genetisk manipuleret til over-express C7 18. Som det ses i figur 2, invasion af RDEB CSCC keratinocytter var signifikant forsinket i C7-overudtrykker native matricer i …

Discussion

På grund af karakteren af ​​dette forsøg, kan den samlede tid, der kræves for færdiggørelse være op til to måneder. I hele denne gang, skal yderste omhu og sterile vævskultur praksis anvendes til at forhindre mikrobiel kontaminering.

Bortset fra sin rolle som en cofaktor i syntesen af hydroxyprolin og hydroxylysin af kollagener, ascorbinsyre stimulerer collagen specifik mRNA-ekspression i fibroblaster ^22. Ascorbinsyre valg her er den mere st…

Materials

L-Ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
DMEM with l-glutamine,	Life Technologies	11995-073
4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate
100x Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070
Vaseline	VWR	PROL28908.290
Clonal cylinders	Sigma	Z370789
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk	Millipore	NY1H02500
Bent stainless steel wire mesh support	Made in house		Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates