Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion
Summary
Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is een opkomende hulpmiddel om een stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.
Abstract
3D organotypische kweken van epitheliale cellen op een matrix ingebed met mesenchymale cellen worden veel gebruikt voor epitheliale celdifferentiatie en invasie bestuderen. Soort rat staart I collageen en / of matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen zijn van oudsher gebruikt als de substraten het modelleren van de matrix of stromale micromilieu waarin mesenchymale cellen (meestal fibroblasten) worden bevolkt. Hoewel experimenten met dergelijke matrices zijn zeer informatief, kan worden gesteld dat door een dwingende aanwezigheid van een enkel eiwit (zoals type I collageen) of een hoog gehalte aan basale membraan componenten en groeifactoren (zoals matrix afgeleid uit muis sarcoom cellen), deze substraten niet de beste bijdrage matrixsamenstelling door de stromale cellen zelf weerspiegelen. Om inheemse matrices geproduceerd door primaire dermale fibroblasten geïsoleerd van patiënten met een tumor gevoelig, genetische blaarvorming stoornis (recessief Dystrofe studerenepidermolysis bullosa), hebben we een bestaande natief matrix protocol tumorcelinvasie studie aangepast. Fibroblasten worden geïnduceerd om hun eigen matrix produceren gedurende langere tijd in kweek. Deze inheemse matrix wordt dan losgemaakt van de cultuur schotel en epitheliale cellen worden gezaaid op het voordat het gehele co-cultuur wordt verhoogd tot het lucht-water grensvlak. Celdifferentiatie en / of invasie kan vervolgens worden beoordeeld in de tijd. Deze techniek biedt de mogelijkheid om epitheliale-mesenchymale cel interacties in een 3D-omgeving beoordelen zonder een synthetisch of buitenlandse matrix met als enige nadeel dat het lange tijd nodig om de natieve matrix produceren. De toepassing van deze techniek Hier beschrijven we het vermogen van een molecuul van fibroblasten type VII collageen, tumorcel invasie te remmen te beoordelen.
Introduction
Het gebruik van biomateriaal in 3D weefselkweek heeft onderzoekers in staat gesteld celgedrag te bestuderen in het laboratorium onder fysiologische omstandigheden meer verwant is aan een in vivo omgeving dan een samengevat met 2D hechting en kunststof. In het bijzonder, naar voren hebben grote vooruitgang geboekt in het modelleren van gelaagde epitheel met de goedkeuring van 3D kweekmethoden bij de lucht-water grensvlak 1-4. Dergelijke technieken getrouw na te bootsen keratinocytdifferentiatie en tumorcelinvasie waardoor meer flexibiliteit en trouw voor onderzoekers bestuderen deze processen. De keuze van biomateriaal substraat aan de stromale omgeving nabootsen heeft vooral betrekking op het gebruik van type I collageen, Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en de-epidermized dermis. Bijvoorbeeld zijn kanker-geassocieerde fibroblasten aangetoond bijdragen aan kankerinvasie 5, initiatie en progressie via stroma-epitheliale interacties 6,7 when gekweekt in dergelijke substraten.
De gouden standaard voor het nabootsen van de stromale omgeving in de huid, het grootste en meest bestudeerde gelaagde epitheel gebruik van dergelijke technieken is te de-epidermized humane dermis (DED) beschouwd. Bereiding van DED betreft het verwijderen van de epidermis via trypsine of fysische dissociatie van menselijke kadaver huid 3,4. Niettemin kan de toegang tot dergelijke huid zeer moeilijk zijn voor laboratoria niet geassocieerd met klinische instellingen, en zieke dermis is bijna onmogelijk te verkrijgen. Als alternatief, laboratoria gebruiken vaak een combinatie van type I collageen (geïsoleerd uit staarten rat) en / of Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix.
Na de ontdekking in 1927 door Nageotte 8 dat collageen gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd met behulp van azijnzuur en zout neerslag, werd de toepassing ervan op weefselkweek vervolgens ontwikkeld door huzella en collega's 9. Collageen coating bleek superieur aan glas voor celkweek van 29 stammen en weefselexplantaten als ondervraagd door Ehrmann en Gey 9 te zijn. Momenteel is de belangrijkste soort collageen in weefselcultuur van rat-staart pezen en wordt meestal gekocht van commerciële bronnen. Echter, het nadeel voor een getrouwe substraat recapitulatie is dat de rattenstaart collageen is niet identiek aan menselijk collageen, of de menselijke dermis, waar type I en III collageen aanwezig als belangrijkste bestanddelen zijn, en geïsoleerde rattenstaart collageen is altijd gefragmenteerd.
Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix is een geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door gekweekte Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoomcellen 10. De belangrijkste bestanddelen zijn laminin, type IV collageen, heparine sulfaat proteoglycanen, entactine en nidogen en de precieze verhoudingen van deze eiwitten zal variëren van partij tot partij. Naast structurele proeiwitten, deze matrix bevat ook aanzienlijke niveaus van groeifactoren zoals transformerende groeifactor β, epidermale groeifactor, insuline-achtige groeifactor 1, runder fibroblast groeifactor en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor die celgedrag 11,12 zou veranderen. De richting van de enorme complexiteit van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix, een totaal van 1851 eiwitten werden geïdentificeerd in een recente proteomics onderzoek 13. In het licht van de rijke en complexe aard van deze matrix, is voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren en vergelijken van verschillende experimenten met het gebruik van het 11.
Onze laboratoria hebben een grote interesse in genetische huidziekten, met name die met een aanleg voor het ontwikkelen van plaveiselcelcarcinoom van de huid (CSCC) 14. Bij recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB), ernstige blaarvorming ziekte met kiembaanmutaties in COL7A1 gen <sup> 15-17, hebben wij vastgesteld dat de dermale micro bij deze patiënten tumorbevorderend 18. In de loop van deze studie konden we geen tumor bevorderende eigenschappen van dermale fibroblasten ingebed in collageen I / Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en onderzocht hoe beoordelen eigen, inheemse matrix cellen te beoordelen. Om dit te bereiken, hebben we bewerkt een eerdere techniek vanuit het laboratorium van Lucie Germain werken op de menselijke huid equivalenten 19,20. Techniek Germain kon menselijke huid reconstrueren overzichtelijke basaalmembraan met primaire humane keratinocyten en fibroblasten kweken in afwezigheid van een synthetisch of cadaveric steiger.
In dit artikel worden de stappen die gebruikt worden om de cutane tumor stromale micro-omgeving (native matrix) recapituleren direct afgeleid uit primaire stromale fibroblasten in vitro worden beschreven 18. Inheemse matrices produced door langdurige kweek van fibroblasten werden als een dermale equivalent aan assay voor CSCC celinvasie. We presenteren gegevens met behulp natieve matrix verkregen uit de extracellulaire matrix afgescheiden door RDEB fibroblasten (tekort bij type VII collageen (C7)) of RDEB fibroblasten retroviraal getransduceerde met type VII collageen expressie construct en tonen de grote invloed van een collageen op tumor celinvasie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de aard van dit experiment, kan de totale tijd van uitvoering maximaal twee maanden. Gedurende deze tijd moeten uiterste zorg en steriele weefselkweek methoden worden toegepast om microbiële contaminatie te voorkomen.
Naast zijn rol als cofactor bij de synthese van hydroxyproline en hydroxylysine van collagenen, ascorbinezuur stimuleert collageen mRNA expressie in fibroblasten 22. Het ascorbinezuur keuze hier is het stabieler L-ascorbinezuur 2-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
APS wordt ondersteund door Debra International en de Britse Skin Foundation. YZN wordt ondersteund door A * STAR – University of Dundee Partnership PhD-programma.
Materials
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
| 4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- . BD Biosciences – Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , .
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , .
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
