癌症干细胞从人类前列腺癌样本隔离

Summary

肿瘤干细胞（肿瘤干细胞）直接从人体组织中的隔离是必要的其生物学特性。这个手稿描述了从人体组织前列腺肿瘤干细胞的分离的方法，同时还提供疑难排解困难的步骤提示。

Abstract

癌症干细胞（CSC）型号已大大超过重新审视过去二十年。在这段时间的CSCs已经确定并直接分离自人组织和串联传播在免疫缺陷小鼠中，通常是通过细胞和分馏通过流式细胞术的亚群的抗体标记。然而，前列腺癌的独特临床特征有很大限制从人类的肿瘤标本前列腺肿瘤干细胞的研究。我们最近报道的前列腺肿瘤干细胞直接从人体组织凭借自己的HLA I类（HLAI）阴性表型的隔离。前列腺癌的细胞是从手术标本收集和机械解离。细胞悬液生成和标有荧光标记的HLAI和间质抗体。 HLAI阴性细胞亚群用流式细胞仪最终分离。该协议的主要限制是经常微观和多灶性性质原发癌在前列腺切除标本。尽管如此，独立的活前列腺肿瘤干细胞是适合的分子特征和功能验证通过移植免疫缺陷小鼠。

Introduction

瘤内的异质性被认为是癌症¹的标志。事实上，肿瘤内的异质性的几种机制已经描述了，包括基因突变，并与微环境相互作用。此外，一些癌症可能含有与癌症干细胞（肿瘤干细胞）亚群表现出的肿瘤起始能力和自我更新的串行移植实验^2-5的属性蜂窝层次。在血液学^6，乳腺癌^7，和脑⁸恶性肿瘤最初描述，肿瘤干细胞也已经研究了前列腺癌^9-12以及其他类型的肿瘤^2-5。

肿瘤干细胞通常被认为是一个异质群体^2-5中的细胞部分。因此，肿瘤干细胞的功能和分子特征是在从大量人群的充实队伍。因此，在过去的二十年里遇到几个CSC富集hodologies已经设计出通常涉及标记人群通过流式细胞仪分离。另外，在肿瘤干细胞的研究的显著考虑的是，人体组织的层次组织可以通过实验操作，例如在培养物或免疫缺陷小鼠中连续传代被打乱。其结果是，从人体组织的CSCs的直接分离已经成为在CSC领域的一个重要方法。

前列腺癌是癌症的发病率和死亡率在美国和世界各地¹³的主要原因。因此，前列腺肿瘤干细胞的分离和生物学特性是显著的兴趣。前列腺肿瘤干细胞先前已经从富集的细胞系，来自患者的移植，以及低传来自患者的悬浮培养^{9,10,12,14。}

我们最近报道的前列腺肿瘤干细胞直接从人的手术S中的隔离amples凭借自己HLAI阴性细胞表面表型^10。在这里，我们详细地实施了这些细胞的分离的过程。前列腺肿瘤是从手术标本采集后制成细胞悬液。然后将细胞用抗HLAI抗体以及基质和生存能力标记染色，肿瘤干细胞是通过荧光激活细胞分选术（FACS）分离。孤立的CSCs可以被用于需要活细胞测定法。

Protocol

1。采收和从手术标本人前列腺癌组织处理制备含有15毫升Roswell公园纪念研究所（RPMI）含10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素1640培养基250毫升聚苯乙烯锥形管中。 病理学服务人员从收获前列腺切除和姑息手术标本原发性和转移性前列腺癌样本，分别根据机构审查委员会批准的协议。转移性样本可以从淋巴结清扫术中主要手术来获得，在此期间在诊断除去单个转移灶，其中包括姑…

Representative Results

图1。人类前列腺癌肿瘤的收获和流式细胞仪曲线图，展示从人类前列腺癌的特定人群（A）肿瘤结节收获生成细胞悬液。经处理的样品的肿瘤含量用常规苏木精和曙红染色证实。 （B）细胞为DAPI染色阳性被排除隔离只存活细胞。 （ <str…

Discussion

本协议描述的CSCs的从新鲜人前列腺癌组织中的隔离。几个重要的考虑因素影响本协议的成功结果。

高数可行前列腺癌细胞的恢复依赖于外科手术样品小心总的评估。在我们的经验，致瘤性的前列腺细胞的成功分离，最好保证当肉眼可见的肿瘤结节观察和处理^10。

然而，从前列腺切除标本派生时下原发病常常是多灶性和微观。在这些情况下，当可?…

Materials

RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning cell gro	21-031-CM
60 mm-15 mm cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conial tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tune	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	ebioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480