Isolement de cellules souches du cancer à partir d'échantillons cancer de la prostate humaine
Summary
L'isolement des cellules souches cancéreuses (CCM) directement à partir de tissus humains est nécessaire pour leur caractérisation biologique. Ce manuscrit décrit une méthodologie pour l'isolement des CSC de la prostate à partir de tissus humains, tout en offrant des conseils sur le dépannage des mesures difficiles.
Abstract
Le modèle de cellules souches du cancer (SCC) a été considérablement revu au cours des deux dernières décennies. Pendant ce temps, les CSC ont été identifiés et directement isolé à partir de tissus humains et en série propagé dans des souris immunodéficientes, généralement grâce à l'étiquetage des anticorps de sous-populations de cellules et de fractionnement par cytométrie de flux. Cependant, les caractéristiques cliniques uniques de cancer de la prostate ont considérablement limité l'étude de la CSC de la prostate à partir d'échantillons frais de tumeurs humaines. Nous avons récemment rapporté l'isolement des CSC de la prostate directement à partir de tissus humains en raison de leur classe de phénotype HLA I (HLAI)-négatif. des cellules de cancer de la prostate sont récoltées à partir de pièces chirurgicales et dissociées mécaniquement. Une suspension de cellules est généré et marqué avec des anticorps conjugués HLAI stromales et par fluorescence. Les sous-populations de cellules HLAI négatifs sont finalement isolés en utilisant un cytomètre de flux. La principale limitation de ce protocole est la nature souvent microscopique et multifocalecancer primaire en pièces de prostatectomie. Néanmoins, isolés CSC de la prostate en direct sont appropriés à la caractérisation moléculaire et la validation fonctionnelle par transplantation dans des souris immunodéficientes.
Introduction
Hétérogénéité intratumorale est considérée comme une caractéristique du cancer 1. En effet, plusieurs mécanismes d'hétérogénéité intratumorale ont été décrites, y compris la mutation génétique et les interactions avec le micro-environnement. En outre, certains cancers peuvent contenir une hiérarchie cellulaire avec une sous-population de cellules souches cancéreuses (CCM) qui présente des propriétés de capacité de la tumeur et initier l'auto-renouvellement dans des essais de transplantation de série 2-5. Initialement décrit dans hématologique 6, du sein 7, 8 et les tumeurs malignes du cerveau, CCF ont également été étudiés dans le cancer de la prostate 9-12 ainsi que d'autres types de tumeurs 2-5.
CSC sont généralement considérés comme une fraction cellulaire dans une population hétérogène 2-5. Par conséquent, la caractérisation fonctionnelle et moléculaire du CSC est subordonnée à leur enrichissement des populations en vrac. En conséquence, au cours des deux dernières décennies, plusieurs se sont réunishodologies d'enrichissement SCC ont été élaborées qui impliquent généralement la séparation des populations marquées par cytométrie de flux. En outre, une considération importante dans l'étude de la CSC est que l'organisation hiérarchique des tissus humains peut être perturbée par des manipulations expérimentales telles que passages en série en culture ou immunodéficientes souris. En conséquence, l'isolement direct des CSC de tissus humains a émergé comme une méthode importante dans le domaine du SCC.
cancer de la prostate est une cause majeure de morbidité et de mortalité aux États-Unis et partout dans le monde 13 cancer. Par conséquent, l'isolement et la caractérisation biologique des CSC de la prostate est d'un grand intérêt. CCF de la prostate ont été préalablement enrichi à partir de lignées cellulaires dérivées de patients, des xénogreffes, et une faible passage de patients provenant de cultures en suspension 9,10,12,14.
Nous avons récemment rapporté l'isolement des CSC de la prostate directement à partir de chirurgicales humainesexemples en vertu de leur HLAI négatif surface cellulaire phénotype 10. Ici, nous détaillons les procédures mises en place pour l'isolement de ces cellules. tumeurs de la prostate sont récoltées à partir de prélèvements chirurgicaux et transformées en suspensions cellulaires. Les cellules sont ensuite colorées à l'aide d'anticorps contre HLAI ainsi que des marqueurs de stroma et de viabilité, et les CCM sont isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). CSC isolées peuvent ensuite être utilisés pour les essais nécessitant cellules viables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l'isolement de CCF à partir de tissus de cancer de la prostate humain frais. Plusieurs facteurs importants influent sur le succès de ce protocole.
La récupération des nombres élevés de cellules cancéreuses de la prostate viables dépend de l'évaluation brute minutieuse des échantillons chirurgicaux. Dans notre expérience, l'isolement réussi de cellules de la prostate tumorigènes est mieux assurée lorsque nodules tumoraux macroscopiques sont obser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Hariri famille et la TJ Martell Foundation.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
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