के लिग्निन नीचे विनियमन<em> मकाय</em> DsRNAi और Klason Lignin विश्लेषण के माध्यम से
Summary
एक डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (dsRNAi) तकनीक मक्का cinnamoyl कोएंजाइम कम संयंत्र लिग्निन सामग्री के लिए एक रिडक्टेस (ZmCCR1) जीन नीचे विनियमित करने के लिए कार्यरत है. सेल की दीवार से लिग्निन नीचे विनियमन सूक्ष्म विश्लेषण द्वारा कल्पना और Klason विधि द्वारा मात्रा निर्धारित है. Hemicellulose और क्रिस्टलीय सेलूलोज में compositional परिवर्तन विश्लेषण कर रहे हैं.
Abstract
जैविक रूपांतरण की प्रक्रिया के दौरान एक वैकल्पिक bioenergy संसाधन के रूप में lignocellulosic बायोमास के उपयोग की सुविधा के लिए, एक pretreatment कदम कोशिका दीवार कार्बोहाइड्रेट की पहुंच बढ़ाने, संयंत्र सेल दीवार की संरचना को खोलने की जरूरत है. लिग्निन, कई सेल दीवार प्रकार में मौजूद एक polyphenolic सामग्री, का उपयोग एंजाइम के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा होने के लिए जाना जाता है. संयंत्र की संरचनात्मक अखंडता और रक्षा प्रणाली के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक स्तर तक लिग्निन सामग्री में कमी bioethanol उत्पादन की लागत को कम करने के लिए एक मूल्यवान कदम हो सकता है. इस अध्ययन में, हम आनुवंशिक रूप से एक डबल असहाय शाही सेना के हस्तक्षेप तकनीक के माध्यम से लिग्निन जैवसंश्लेषण से संबंधित जीन में से एक, cinnamoyl सीओए रिडक्टेस (ZmCCR1) नीचे विनियमित है. ZmCCR1_RNAi निर्माण कण बमबारी विधि का उपयोग मक्का जीनोम में एकीकृत किया गया. ट्रांसजेनिक मक्का के पौधों में बिना जंगली प्रकार नियंत्रण पौधों की तुलना में सामान्य रूप से बढ़ीट्रांसजेनिक पौधों के पत्ते मध्य पसलियों, भूसी में भूरे रंग के प्रदर्शित करने के अपवाद के साथ, बायोमास विकास या सुरक्षा तंत्र के साथ terfering, और उपजा है. सूक्ष्म विश्लेषण, ऊतकीय परख के साथ संयोजन के रूप में, पत्ती बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण फाइबर पतला कर रहे थे लेकिन अन्य प्रमुख नाड़ी तंत्र घटकों की संरचना और आकार बदल नहीं था कि पता चला. ट्रांसजेनिक मक्का में लिग्निन सामग्री 7-8.7% की कमी थी, क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री लिग्निन कमी के जवाब में वृद्धि हुई है, और hemicelluloses अपरिवर्तित रहा था. विश्लेषण करती है कि कार्बन प्रवाह सेलूलोज जैव संश्लेषण के लिए लिग्निन जैवसंश्लेषण से स्थानांतरित कर दिया गया हो सकता है का संकेत हो सकता. यह लेख आरएनएआई प्रौद्योगिकी के माध्यम से मक्का में लिग्निन सामग्री नीचे विनियमित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं रूपरेखा बनाती है, और सेल दीवार compositional कोशिका दीवार संरचना पर संशोधनों के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषण करती है.
Introduction
lignocellulosic बायोमास से जैव ईंधन के उत्पादन की वजह से अमेरिका 1 में इसके वर्तमान बहुतायत के लिए अति आवश्यक है, और कृषि और वानिकी अवशेषों की स्थायी फसल के मामले में, भोजन और पशु चारा उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया cropland के लिए सीधे प्रतिस्पर्धा नहीं करने की क्षमता. हालांकि, वर्तमान में अमेरिका में उत्पन्न जैव ईंधन का मुख्य स्रोत है, जो मक्का अनाज, के विपरीत, lignocellulosic सामग्री काफी अधिक जटिल और मुश्किल नीचे तोड़ने के लिए कर रहे हैं. लंबी श्रृंखला कार्बोहाइड्रेट, सेलूलोज़ और hemicellulose, lignocellulosic सामग्री के किण्वन के दौरान शक्कर का मुख्य स्रोत हैं, जो संयंत्र सेल दीवारों के कई प्रकार के भी लिग्निन होते हैं, रोगज़नक़ हमले के खिलाफ ताकत, रक्षा प्रदान करता है कि एक phenylpropanoid बहुलक, और hydrophobicity के अलावा दीवारों सेल. संयंत्र विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक है, जबकि लिग्निन भी सेलूलोज और hemicellu के सफल एंजाइमी रूपांतरण के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा प्रस्तुतघुलनशील शर्करा को खो देते हैं. उच्च लिग्निन सामग्री के साथ सामग्री आम तौर पर (जैविक रूपांतरण रास्ते के माध्यम से) जैव ईंधन और प्रसंस्करण विशेषताओं और उत्पाद की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभावों के कारण लुगदी और कागज उद्योग दोनों के लिए कम वांछनीय सामग्री रहे हैं. इसलिए, फसल संरचनात्मक ताकत और रक्षा प्रणालियों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक स्तर पर लिग्निन कमी के लिए संयंत्र सामग्री की आनुवंशिक हेरफेर lignocellulosic जैव ईंधन और लुगदी और कागज उद्योग दोनों के लिए उत्पादन लागत में कमी के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है.
मक्का (मक्का) में, लिग्निन covalently ferulate और diferulate पुलों 2 के माध्यम से प्राथमिक कोशिका दीवार में hemicellulose के लिए पार से जुड़े है. लिग्निन-hemicellulose जटिल माध्यमिक सेल दीवार को ईमानदारी और ताकत प्रदान कि एक जटिल मैट्रिक्स के गठन, हाइड्रोजन बांड के माध्यम से सेलूलोज़ microfibrils को बांधता है. संयंत्र सेल दीवारों के यांत्रिक शक्ति काफी हद तक ली के प्रकार से निर्धारित होता हैgnin 3-5 यूनिटों. पिछले अध्ययनों में, लिग्निन सब यूनिटों के अनुपात में फेरबदल एंजाइमी पाचनशक्ति 6-11 पर कोई स्पष्ट प्रवृत्ति दिखाई है. हालांकि, लिग्निन सामग्री में कटौती आम तौर पर रूपांतरणों 12,13 में एक सुधार दिखा और endocellulases, cellobiohydrolases, और β-glucosidases 14 सहित hydrolytic एंजाइमों से संयंत्र सामग्री की पाचनशक्ति को बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण हो सकता है.
टेप की अभिव्यक्ति के स्तर को विनियमित करने के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग बड़े पैमाने पर फसल लक्षण में सुधार करने के लिए अभ्यास किया गया है. विरोधी भावना 15 और सह दमन 16 प्रौद्योगिकियों सहित उन्नत तकनीक, नीचे विनियमन लक्ष्य जीन की प्रभावी सक्षम. पूरी जीन दस्तक बाहर भी एक बाल के लिये कांटा संरचना 17 से Intron-spliced आरएनए जीन एन्कोडिंग निर्माणों का प्रयोग कर प्राप्त किया गया है. इसके अलावा, एक डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (dsRNAi) तकनीक, यानी एक शक्तिशाली और प्रभावी जीन अभिव्यक्ति मीडियालक्षित कर प्रतिलेख गिरावट या अनुवाद दमन या तो द्वारा काम करता है कि टो, लक्ष्य mRNA 18 पर दमन प्रभाव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रेरित करने के लिए एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है. जीन मुंह तकनीक कई सीमाएं दिखा. इन तकनीकों में ठीक प्रतिलेखन के स्तर को विनियमित नहीं है और यह अन्य मुताबिक़ जीन पर अप्रत्याशित मुंह बंद प्रभाव हो सकता है.
इस विधि में, हम dsRNAi मक्का जीनोम में constructs ले जाने के लिए कण बमबारी कार्यरत हैं. तिथि करने के लिए, पौधों की प्रजातियों की एक विशाल सरणी सफलतापूर्वक कण बमबारी, Agrobacterium मध्यस्थता परिवर्तन, electroporation, और microinjection तरीकों का उपयोग बदल दिया गया है. यह सबसे कारगर है क्योंकि मक्का आनुवंशिक परिवर्तन में, कण बमबारी विधि सभी अन्य तरीकों से अधिक लाभप्रद है. कण बमबारी बैक्टीरिया पर निर्भर नहीं है, तो विधि ऐसे जीन की जीन, प्रजातियों का आकार या रूप में जैविक बाधाओं से मुक्त हैigin, या संयंत्र जीनोटाइप. शारीरिक transgene वितरण प्रणाली उच्च परिवर्तन दक्षता 19 में क्लोरोप्लास्ट में संयंत्र जीनोम में और कुछ मामलों में पेश होने के लिए उच्च आणविक वजन डीएनए और कई जीनों में सक्षम बनाता है. पत्ती के मध्य रिब की नाड़ी तंत्र में लिग्निन कमी नमूनों की स्थलाकृति और संरचना की जांच के लिए फायदेमंद है जो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के माध्यम से देखे जा सकते हैं.
मक्का के पौधों में, cinnamoyl सीओए रिडक्टेस की दो (ZmCCR1: X98083 और ZmCCR2: Y15069) जीन मक्का जीनोम 20 में पाया गया. Cinnamoyl सीओए रिडक्टेस cinnamyl aldehydes में hydroxycinnamoyl सीओए एस्टर का रूपांतरण catalyzes. जीन सभी lignifying ऊतकों में व्यक्त किया है क्योंकि हम इस एंजाइम नीचे विनियमित करने ZmCCR1 जीन चुना है. दृश्यों होना को दिखाई दिया क्योंकि ZmCCR1 जीन की 3 'टर्मिनस पर 523 nucleotides एक dsRNAi निर्माण के लिए चुना गयाZmCCR2 के उन लोगों की तुलना में अधिक विविध. इस प्रकार, dsRNAi निर्माण ठीक 21 मुंह बंद बंद लक्ष्य से परहेज ही ZmCCR1 के लिए बाध्य होगा. एक ZmCCR1_RNAi निर्माण cytoplasmic अभिव्यक्ति प्रणाली ImpactVector1.1 टैग में इंजीनियर था (चतुर्थ 1.1) हरी ऊतक विशिष्ट प्रमोटर युक्त, ribulose-1, 5 बाइफोस्फेट कार्बोज़ाइलेस oxygenase (RuBisCO).
DsRNAi ट्रांसजेनिक पौधों पर निर्माण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, लिग्निन सामग्री मात्रा निर्धारित किया गया था. Klason (एसिड अघुलनशील) लिग्निन माप लिग्निन 22 के कुछ solubilize जो एसिड डिटर्जेंट लिग्निन मात्रा का ठहराव तरीकों की तुलना में अधिक सटीक होना करने के लिए जाना जाता है. इसलिए, Klason लिग्निन ट्रांसजेनिक मक्का डंठल में मापा गया था. इस प्रक्रिया में घुलनशील मोनोसैक्राइडों 23 में polymeric कार्बोहाइड्रेट धर्मान्तरित एक दो कदम एसिड हाइड्रोलिसिस के होते हैं. हाइड्रोलाइज्ड बायोमास तो एसिड घुलनशील और अघुलनशील materi में fractionated गया थाए एल एस और एसिड अघुलनशील लिग्निन पिछले अध्ययनों 23,24 के अनुसार मापा गया था. आदर्श रूप में, लिग्निन विश्लेषण पिछले परिणामों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि घुलनशील सामग्री हटाने के लिए आदेश में हाइड्रोलिसिस कदम है, और अवशेषों में मौजूद किसी भी राख के लिए खाते में लिग्निन अवशेषों की एक के बाद हाइड्रोलिसिस दहन करने के लिए पानी और इथेनॉल के साथ एक्सट्रेक्शन को शामिल करना चाहिए. इन कदमों के बिना, नमूना के लिग्निन सामग्री कृत्रिम फुलाया जा सकता है. पूर्ण विधि हालांकि हमारे प्रयोगों के लिए हम कारण परीक्षण के लिए उपलब्ध सामग्री की छोटी मात्रा के लिए इन चरणों के दोनों प्रदर्शन करने में असमर्थ थे, यहां प्रस्तुत किया है
दो अन्य सेल दीवार घटकों, सेलूलोज़ और hemicellulose भी लिग्निन नीचे विनियमित ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों में विश्लेषण किया गया. यह बताया गया है कि या तो उनके फेनिलएलनिन अमोनिया lyase (पाल) 25, 4 coumarate में नीचे विनियमित किया गया है कि ट्रांसजेनिक पौधों: कोए ligase (4CL) 26, या cinnamyl एकlcohol डिहाइड्रोजनेज (सीएडी) 27 अन्य सेल दीवार संरचनात्मक घटकों में वृद्धि दिखा. हमारे अध्ययन में एक पहला कदम के रूप में, क्रिस्टलीय सेलूलोज Updegraff विधि 28 का उपयोग कर मापा गया था. इस विधि मूल रूप से Cellulolytic बैक्टीरिया और कवक की एक बड़ी संख्या में सेलूलोज के निर्धारण के लिए तैयार किया गया था. Hemicellulose, लिग्निन, और xylosans दूर करने के लिए संक्षेप में, milled मक्का शेयरों Updegraff अभिकर्मक (पानी: नाइट्रिक एसिड एसिटिक एसिड) के साथ इलाज किया गया. क्रिस्टलीय सेलूलोज पूरी तरह से तो 4 एच 2 जोड़कर Saeman हाइड्रोलिसिस के माध्यम से ग्लूकोज में hydrolyzed गया था. क्रिस्टलीय सेलूलोज तो वर्णमिति anthrone विधि 29 का उपयोग assayed किया गया था. Hemicellulose सामग्री बदल रहे थे, तो सत्यापित करने के लिए, milled डंठल से मोनोसैकराइड अर्क, trifluoroacetic एसिड का उपयोग hydrolyzed alditol एसीटेट विधि का उपयोग derivatized और फिर गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) 30 से विश्लेषण किया गया. क्रिस्टलीय सीईएल के लिए विस्तृत प्रक्रियाओंlulose सामग्री और मैट्रिक्स polysaccharides रचना विश्लेषण फोस्टर एट अल में वर्णित हैं. (2010) 31.
यहाँ, हम लिग्निन के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं का वर्णन नीचे विनियमन एक आरएनएआई प्रौद्योगिकी, कण बमबारी परिवर्तन, और जैव ईंधन के लिए उफानने शर्करा में मक्का lignocellulosic बायोमास के त्वरित deconstruction के लिए लिग्निन विश्लेषण के माध्यम से मक्का में.
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल दीवार polysaccharides संयंत्र के लिए माइक्रोबियल cellulases की पहुंच है, जो वे phenolic पॉलिमर 23 के साथ जुड़े रहे हैं करने के लिए डिग्री पर काफी हद तक निर्भर है. चीनी उफानने को lignocellulosic बायोमास से रूपांतरण दर नकारात्मक स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सूक्ष्म इमेजिंग उन्नत माइक्रोस्कोपी के लिए मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी सेंटर की सेवाओं के माध्यम से आयोजित किया गया. मक्का घट्टा आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के मक्का परिवर्तन केंद्र से खरीदा गया था. लेखकों कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण पर अपने तकनीकी सहायता के लिए MSU संयंत्र अनुसंधान प्रयोगशाला के जेफरी आर Weatherhead धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध उदारता मिशिगन मकई विपणन कार्यक्रम (CMPM) और पादप जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए कंसोर्टियम (CPBR) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Media | Chemical compositions | ||
| N6OSM | 4 g/l N6 salts | ||
| (Osmotic medium) | 1 ml/l N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 0.69 g/L proline | |||
| 30 g/l sucrose | |||
| 100 mg/L casein hydrolysate | |||
| 36.4 g/l sorbitol | |||
| 36.4 g/l mannitol | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8 | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| N6E | 4 g/l N6 salts | ||
| (Callus induction) | 1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 2.76 g/l proline | |||
| 30 g/l sucrose | |||
| 100 mg/l casein hydrolysate | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8. | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| N6S media | 4 g/l N6 salts | ||
| (Selection media) | 1 ml/l N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 0.69 g/L proline | |||
| 30 g/L sucrose | |||
| 100 mg/L casein hydrolysate | |||
| 36.4 g/l sorbitol | |||
| 36.4 g/l mannitol | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8 | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| Regeneration medium | 4.3 g/L MS salts | ||
| 1 ml/L (1000X) MS vitamin stock | |||
| 100 mg/L myo-inositol | |||
| 60 g/L sucrose | |||
| 3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates) | |||
| Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving. | |||
| Rooting medium | 4.3 g/L MS salts | ||
| 1 ml/L MS vitamin stock | |||
| 100 mg/L myo-inositol | |||
| 30 g/L sucrose | |||
| 3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates). | |||
| Specific materials | |||
| Screw-top high pressure tubes | Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ | ||
| Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ | |||
| 10% Neutral buffered formalin | 100ml of formalin | ||
| (1 liter) | 900ml of ddH2O | ||
| 4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate | |||
| (NaH2PO4.H2O) | |||
| Equipments | |||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States) | |||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) | |||
| Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States). | |||
| HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States) | |||
| Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States) | |||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England) | |||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) | |||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | |||
| MA35 Moisture Analyzer; Sartorius | |||
| Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States) |
References
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