Summary

La lignina down-regulation dei<em> Zea mays</em> Via dsRNAi e Klason lignina analisi

Published: July 23, 2014
doi:

Summary

Un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica viene impiegata per down-regolare il coenzima mais cinnamoil A reduttasi (ZmCCR1) gene a basso contenuto di lignina pianta. La lignina down-regulation dalla parete cellulare viene visualizzato mediante analisi al microscopio e quantificato con il metodo Klason. Cambiamenti di composizione in emicellulosa e cellulosa cristallina vengono analizzati.

Abstract

Per facilitare l'uso di biomassa lignocellulosica come risorsa bioenergia alternativa, durante i processi di conversione biologici, è necessaria una fase di pretrattamento per aprire la struttura della parete cellulare, aumentando l'accessibilità dei carboidrati della parete cellulare. Lignina, un materiale polifenolico presente in molti tipi di parete cellulare, è noto per essere un ostacolo significativo enzimatica accesso. Riduzione del contenuto di lignina ad un livello tale da non interferire con l'integrità e difesa sistema strutturale dell'impianto potrebbe essere un passo importante per ridurre i costi di produzione di etanolo. In questo studio, abbiamo geneticamente down-regolato uno dei geni della biosintesi legati lignina, cinnamoil-CoA reduttasi (ZmCCR1) tramite un doppio filamento di RNA tecnica interferenze. Il costrutto ZmCCR1_RNAi è stato integrato nel genoma del mais con il metodo del bombardamento di particelle. Piante di mais transgeniche crescevano normalmente rispetto alle piante di controllo wild-type senza aterfering con una crescita di biomassa o meccanismi di difesa, con l'eccezione della visualizzazione di colore marrone-colorazione in transgeniche piante a foglia metà costole, bucce e gambi. Le analisi microscopiche, in combinazione con il dosaggio istologica, hanno rivelato che le fibre sclerenchima foglia furono diradate ma la struttura e le dimensioni di altri componenti principali del sistema vascolare non è stato modificato. Il contenuto di lignina nel mais transgenico è stato ridotto del 7-8,7%, il contenuto di cellulosa cristallina è stata aumentata in risposta alla riduzione della lignina, emicellulose e rimasto invariato. Le analisi possono indicare che il flusso di carbonio potrebbe essere stato spostato dalla biosintesi di lignina alla biosintesi di cellulosa. Questo articolo delinea le procedure utilizzate per down-regolare il contenuto di lignina nel mais tramite tecnologia RNAi, e l'analisi composizionale parete cellulare utilizzato per verificare l'effetto delle modifiche sulla struttura della parete cellulare.

Introduction

La produzione di biocarburanti da biomassa lignocellulosica è altamente auspicabile per la sua abbondanza presente negli Stati Uniti 1, e nel caso della raccolta sostenibile dei residui agricoli e forestali, la capacità di non competere direttamente per il terreno agricolo utilizzato per l'alimentazione animale e produzione di mangimi. Tuttavia, a differenza di granturco, che è la principale fonte di biocarburante attualmente generata negli Stati Uniti, materiali lignocellulosici sono significativamente più complesso e difficile da abbattere. Oltre al carboidrati a catena lunga, cellulosa ed emicellulosa, che sono le principali fonti di zuccheri durante la fermentazione di materiali lignocellulosici, molti tipi di pareti cellulari delle piante contengono anche lignina, un polimero stirene che fornisce la resistenza, difesa contro attacco patogeno, e idrofobicità alla cella pareti. Mentre necessario per la crescita delle piante e la sopravvivenza, lignina presenta anche un ostacolo significativo per la conversione enzimatica successo della cellulosa e hemicelluperdere di zuccheri solubili. I materiali ad alto contenuto di lignina sono in genere materiali meno desiderabili sia per il biocarburante (attraverso percorsi di conversione biologica) e la polpa e della carta a causa di impatti negativi sulle caratteristiche di lavorazione e la qualità del prodotto. Quindi, la manipolazione genetica di materiali vegetali per la riduzione lignina ad un livello che non interferisce con la coltura resistenza strutturale e sistemi di difesa potrebbe essere importante per la riduzione dei costi di produzione sia per il biocarburante lignocellulosica e le industrie cartiere.

Nel mais (Zea mays), lignina è covalentemente reticolato di emicellulosa nella parete cellulare primaria attraverso Ferulate e ponti diferulate 2. Il complesso lignina-emicellulosa lega a microfibrille di cellulosa attraverso legami idrogeno, formando una matrice complessa che conferisce integrità e resistenza alla parete cellulare secondaria. La resistenza meccanica delle pareti cellulari delle piante è in gran parte determinato dal tipo di lignin subunità 3-5. In studi precedenti, alterando le proporzioni di subunità lignina ha mostrato alcuna tendenza chiara sulla digeribilità enzimatica 6-11. Tuttavia, la riduzione del contenuto di lignina generalmente mostrano un miglioramento conversioni 12,13 e può essere una chiave per aumentare la digeribilità del materiale vegetale da enzimi idrolitici compresi endocellulases, cellobiohydrolases, e β-glucosidasi 14.

L'ingegneria genetica per regolare il livello di espressione dei trascritti è stato ampiamente praticato per migliorare le caratteristiche delle colture. Tecniche avanzate, tra cui anti-senso 15 e co-soppressione di 16 tecnologie, consentono efficaci down-regolazione dei geni bersaglio. Completa gene knock-out è stato raggiunto anche utilizzando costrutti genici codificanti RNA introne-impiombato con una struttura tornante 17. Inoltre, un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica, vale a dire un mezzo di espressione genica potente ed efficacetor che funziona da una mira degradazione trascrizione o di traduzione repressione, fornisce un potente mezzo per indurre una vasta gamma di effetti di soppressione sul bersaglio mRNA 18. Tecniche di silenziamento genico mostrano diversi limiti. Queste tecniche non regolano con precisione il livello di trascrizione e potrebbe causare effetti silenziamento impreviste su altri geni omologhi.

In questo metodo, abbiamo impiegato bombardamento di particelle per trasportare il dsRNAi costruisce nel genoma del mais. Fino ad oggi, una vasta gamma di specie vegetali sono state trasformate con successo utilizzando bombardamento di particelle, Agrobacterium trasformazione mediata, elettroporazione, e metodi di microiniezione. Nel mais trasformazione genetica, il metodo bombardamento di particelle è vantaggioso su tutti gli altri metodi in quanto è il più efficiente. Bombardamento di particelle non dipende batteri, per cui il metodo è privo di vincoli biologici quali le dimensioni del gene, specie di gene oOr igi neCu, o il genotipo pianta. Il sistema fisico consegna transgene consente DNA ad alto peso molecolare e più geni da introdurre nel genoma vegetale e in taluni casi nei cloroplasti ad alta efficienza di trasformazione 19. La riduzione lignina nel sistema vascolare della foglia venatura può essere visualizzato mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) che è vantaggioso per l'esame della topografia e composizione dei campioni.

In piante di mais, due dei reduttasi cinnamoil-CoA (ZmCCR1: X98083 e ZmCCR2: Y15069) geni sono stati trovati nel genoma del mais 20. Cinnamoil-CoA reduttasi catalizza la conversione degli esteri hydroxycinnamoyl-CoA in aldeidi cinnamil. Abbiamo scelto il gene ZmCCR1 di down-regolare questo enzima perché il gene è espresso in tutti i tessuti lignifying. I 523 nucleotidi a terminus 3 'del gene ZmCCR1 sono stati scelti per un dsRNAi costruire perché le sequenze apparivanopiù diversificata rispetto a quelli di ZmCCR2. Così, il costrutto dsRNAi sarebbe proprio legarsi solo a ZmCCR1, evitando off-target tacere 21. Un costrutto ZmCCR1_RNAi è stato progettato nel sistema di espressione ImpactVector1.1-tag citoplasmatica (IV 1.1) contenente il verde tessuto promotore specifico, ribulosio-1, 5-bifosfato carbossilasi ossigenasi (Rubisco).

Per studiare gli effetti della dsRNAi costrutto di piante transgeniche, il contenuto di lignina è stato quantificato. La misurazione lignina Klason (acido insolubile) è noto per essere più precisi rispetto ai metodi acido detergente lignina quantificazione che solubilizzano alcuni dei lignina 22. Pertanto, la lignina Klason stata misurata in stocchi di mais transgenici. Questa procedura consiste di una idrolisi acida in due fasi che converte i carboidrati polimerici in monosaccaridi solubili 23. La biomassa idrolizzato è stato poi frazionato in materi solubili e insolubili in acidoSLA e la lignina insolubile acido è stata misurata secondo studi precedenti 23,24. Idealmente, analisi lignina dovrebbe comprendere estrazioni con acqua ed etanolo prima della fase di idrolisi, per la rimozione delle sostanze solubili che possono interferire con i risultati, e un post-combustione idrolisi del residuo lignina per tenere conto di eventuali ceneri presenti nel residuo. Senza questi passaggi, il contenuto di lignina del campione potrebbe essere artificiosamente gonfiato. Il metodo completo è qui presentata, ma per i nostri esperimenti siamo stati in grado di eseguire entrambe queste operazioni a causa del piccolo volume di materiale disponibile per il test

Altri due componenti della parete cellulare, cellulosa ed emicellulosa sono stati analizzati anche in lignina linee down-regolato mais transgenico. E 'stato riportato che le piante transgeniche che sono state down-regolati in entrambi i loro fenilalanina ammoniaca-liasi (PAL) 25, 4-coumarate: CoA ligasi (4CL) 26, o un cinnamillcohol deidrogenasi (CAD) 27 mostrano un aumento delle altre componenti strutturali della parete cellulare. Come primo passo nei nostri studi, cellulosa cristallina è stata misurata con il metodo Updegraff 28. Questo metodo è stato originariamente ideato per la determinazione di cellulosa in un gran numero di batteri e funghi cellulolitici. In breve, le scorte di mais macinati sono stati trattati con Updegraff reagente (acido acetico: acido nitrico: acqua) per rimuovere emicellulosa, lignina e xylosans. La cellulosa cristallina è stato completamente idrolizzato in glucosio tramite Saeman idrolisi con l'aggiunta di H 2 SO 4. La cellulosa cristallina è stato poi analizzato con il metodo colorimetrico anthrone 29. Per verificare se sono stati modificati i contenuti emicellulosa, gli estratti monosaccaride da steli lavorato sono idrolizzati con acido trifluoroacetico, derivatizzati con il metodo acetato alditolo e poi analizzati mediante gascromatografia (GC) 30. Le procedure dettagliate per cel cristallinaanalisi del contenuto lulose e matrice polisaccaridi composizione sono descritti in Foster et al. (2010) 31.

Qui, descriviamo le procedure utilizzate per la lignina down-regulation nel mais mediante una tecnologia di RNAi, particella bombardamento trasformazione, e l'analisi lignina per la decostruzione accelerata di granturco biomassa lignocellulosica in zuccheri fermentabili per i biocarburanti.

Protocol

1. Preparazione di dsRNAi costrutti utilizzati per la down-regolazione di ZmCCR1 Gene disegno primer specifici, tra cui i siti necessari enzimi di restrizione per fare un dsRNAi costruire knock-out del gene ZmCCR1. Due set di primer sono stati progettati per amplificare due segmenti frammento di ZmCCR1 cDNA:. Un frammento di 523 bp dal nucleotide 748-1271, e un frammento di 285 bp dal nucleotide 986-1271 La ZmCCR1 cDNA è stato fornito dal Genome Institute dell'Arizona …

Representative Results

Abbiamo dimostrato una riduzione del tenore di lignina in piante di mais tramite RNAi. Il metodo di trasformazione bombardamento di particelle ceduto circa il 30% di efficienza trnasformation. Il silenziamento genico di ZmCCR1 è stata costantemente osservata nelle generazioni T0-T2. I transgenici lignina ridotta cresciuto in modo simile a piante di mais di tipo selvatico, tranne per la visualizzazione di colorazione marrone in foglia venatura, buccia, e gambo. L'analisi istologica ha dimostrato che le line…

Discussion

L'accessibilità di cellulasi microbiche per piantare polisaccaridi della parete cellulare dipende in larga misura il grado in cui essi sono associati con polimeri fenolici 23. Il tasso di conversione da biomassa lignocellulosica fermentabili zucchero è correlato negativamente con il contenuto di lignina depositato nelle pareti cellulari secondadry vegetali. Questa correlazione è attribuito alle proprietà fisiche della lignina come idrofobicità 24, eterogeneità chimica, e l'assenza di …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La rappresentazione microscopica è stata condotta tramite i servizi della Michigan State University Center for Advanced Microscopia. Il mais callo è stato acquistato dalla trasformazione centro di mais dell'Iowa State University. Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey R. Weatherhead della MSU Plant Research Laboratory per la sua assistenza tecnica per l'analisi dei carboidrati. Questa ricerca è stata generosamente finanziata dal Programma Corn Marketing del Michigan (CMPM) e il Consorzio per la Plant Biotechnology Research (CPBR).

Materials

Media Chemical compositions
N6OSM 4 g/l N6 salts
(Osmotic medium) 1 ml/l N6 vitamin stock
2 mg/l 2,4-D
100 mg/l myo-inositol
0.69 g/L proline
30 g/l sucrose
100 mg/L casein hydrolysate
36.4 g/l sorbitol
36.4 g/l mannitol
2.5g/l gelrite, pH 5.8
Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E 4 g/l N6 salts
(Callus induction) 1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
2 mg/l 2,4-D
100 mg/l myo-inositol
2.76 g/l proline
30 g/l sucrose
100 mg/l casein hydrolysate
2.5g/l gelrite, pH 5.8.
Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media 4 g/l N6 salts
(Selection media) 1 ml/l N6 vitamin stock
2 mg/l 2,4-D
100 mg/l myo-inositol
0.69 g/L proline
30 g/L sucrose
100 mg/L casein hydrolysate
36.4 g/l sorbitol
36.4 g/l mannitol
2.5g/l gelrite, pH 5.8
Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium 4.3 g/L MS salts
1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
100 mg/L myo-inositol
60 g/L sucrose
3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium 4.3 g/L MS salts
1 ml/L MS vitamin stock
100 mg/L myo-inositol
30 g/L sucrose
3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin  100ml of formalin
(1 liter) 900ml of ddH2O
4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate 
(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States) 
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) 
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
 Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)

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check_url/51340?article_type=t

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Park, S., Ong, R. G., Mei, C., Sticklen, M. Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51340, doi:10.3791/51340 (2014).

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