La lignina Down-regulación de<em> Zea mays</em> Vía dsRNAi y Análisis de lignina Klason

Summary

Una interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) técnica se emplea para regular a la baja la coenzima A reductasa cinamoilo maíz gen (ZmCCR1) a un menor contenido de lignina de la planta. La lignina regulación a la baja de la pared celular se visualiza mediante análisis microscópicos y se cuantifica por el método de Klason. Se analizan los cambios de composición de la hemicelulosa y la celulosa cristalina.

Abstract

Para facilitar el uso de la biomasa lignocelulósica como un recurso bioenergía alternativa, durante los procesos de conversión biológica, se necesita una etapa de pretratamiento para abrir la estructura de la pared celular de la planta, el aumento de la accesibilidad de los hidratos de carbono de la pared celular. La lignina, un material polifenólico presente en muchos tipos de pared celular, se sabe que es un obstáculo significativo a la enzima de acceso. Reducción en el contenido de lignina a un nivel que no interfiere con la integridad y la defensa del sistema estructural de la planta puede ser un paso importante para reducir los costes de la producción de bioetanol. En este estudio, hemos genéticamente las reguladas uno de los genes relacionados con la biosíntesis de lignina, cinamoil-CoA reductasa (ZmCCR1) a través de una técnica de interferencia de ARN de doble cadena. El constructo ZmCCR1_RNAi se integró en el genoma del maíz utilizando el método de bombardeo de partículas. Plantas de maíz transgénicas crecieron normalmente en comparación con las plantas de control de tipo salvaje y sin enterfering con el crecimiento de la biomasa o los mecanismos de defensa, con la excepción de la visualización de color marrón-coloración en plantas transgénicas hoja mediados de los nervios, las cáscaras y tallos. Los análisis microscópicos, en conjunción con el ensayo histológico, revelaron que las fibras de esclerénquima de hojas se apretó pero la estructura y el tamaño de otros componentes principales del sistema vascular no fue alterada. El contenido de lignina en el maíz transgénico se redujo en un 7-8,7%, se aumentó el contenido de celulosa cristalina en respuesta a la reducción de la lignina, hemicelulosas y se mantuvo sin cambios. Los análisis pueden indicar que el flujo de carbono podría haber sido desplazado de la biosíntesis de la lignina para la biosíntesis de la celulosa. Este artículo delinea los procedimientos utilizados para regular a la baja el contenido de lignina en el maíz a través de la tecnología del RNAi, y los análisis de la composición de la pared celular utilizado para verificar el efecto de las modificaciones en la estructura de la pared celular.

Introduction

La producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica es altamente deseable debido a su abundancia actual en los EE.UU. ^1, y en el caso de la cosecha sostenible de los residuos agrícolas y forestales, la capacidad de no competir directamente por las tierras de cultivo utilizado para la alimentación animal y la producción de piensos. Sin embargo, a diferencia de grano de maíz, que es la principal fuente de biocombustible se está generando en los EE.UU., los materiales lignocelulósicos son significativamente más complejo y difícil de romper. Además de la hidratos de carbono de cadena larga, celulosa y hemicelulosa, que son las principales fuentes de azúcares durante la fermentación de materiales lignocelulósicos, muchos tipos de paredes de células vegetales también contienen lignina, un polímero de fenilpropanoides que proporciona fuerza, la defensa contra el ataque de patógenos, y la hidrofobicidad a las paredes celulares. Mientras que es necesario para el crecimiento vegetal y la supervivencia, la lignina también presenta una barrera significativa para la conversión enzimática con éxito de la celulosa y hemicelluperder a los azúcares solubles. Los materiales con alto contenido de lignina son generalmente materiales menos deseables, tanto para el biocombustible (a través de las vías de conversión biológica) y las industrias de pulpa y papel, debido a los impactos negativos sobre las características de procesamiento y la calidad del producto. Por lo tanto, la manipulación genética de los materiales vegetales para la reducción de la lignina en un nivel que no interfiera con la resistencia estructural de los cultivos y los sistemas de defensa podría ser importante para la reducción de los costos de producción, tanto para el biocombustible lignocelulósico y las industrias de pulpa y papel.

En el maíz (Zea mays), la lignina es covalentemente reticulado para la hemicelulosa en la pared celular primaria a través de ferulato y puentes diferulato ^2. El complejo lignina-hemicelulosa se une a las microfibrillas de celulosa a través de enlaces de hidrógeno, formando una matriz compleja que confiere la integridad y la fuerza a la pared celular secundaria. La resistencia mecánica de las paredes celulares de la planta está determinada en gran medida por el tipo de Lignin subunidades ^3-5. En estudios anteriores, la alteración de las proporciones de las subunidades de lignina ha mostrado ninguna tendencia clara en la digestibilidad enzimática ^6-11. Sin embargo, las reducciones en el contenido de lignina en general, muestran una mejora en las conversiones de ^12,13 y pueden ser una clave para el aumento de la digestibilidad de la materia vegetal por las enzimas hidrolíticas incluyendo endocellulases, celobiohidrolasas, y β-glucosidasas ^14.

La ingeniería genética de regular el nivel de expresión de las transcripciones ha sido ampliamente practicada para mejorar características de los cultivos. Las técnicas avanzadas, incluyendo anti-sentido ¹⁵ y cosupresión ¹⁶ tecnologías, permiten efectiva la baja regulación de los genes diana. Completar gen knock-out también se ha conseguido utilizando construcciones de genes que codifican ARN intrón-empalmado con una estructura de horquilla ^17. Además, una interferencia de ARN de doble cadena técnica (dsRNAi), es decir, un medio de expresión génica potente y eficazTor que funciona por cualquiera de focalización degradación de transcripción o traducción represión, proporciona un potente medio para inducir una amplia gama de efectos de supresión en el ARNm diana ^18. Técnicas de silenciamiento génico muestran varias limitaciones. Estas técnicas no regulan con precisión el nivel de la transcripción y que podría causar efectos de silenciamiento inesperadas en otros genes homólogos.

En este método, hemos empleado el bombardeo de partículas para llevar a la dsRNAi construye en el genoma de maíz. Hasta la fecha, una gran variedad de especies de plantas se han transformado con éxito utilizando bombardeo de partículas, transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, y los métodos de microinyección. En la transformación genética del maíz, el método de bombardeo de partículas es ventajoso con respecto a todos los otros métodos, ya que es el más eficiente. El bombardeo de partículas no depende de las bacterias, por lo que el método es libre de limitaciones biológicas, tales como el tamaño de los genes, especies de gen oigin, o el genotipo de la planta. El sistema de suministro de transgén física permite ADN de alto peso molecular y múltiples genes a ser introducidos en los genomas de plantas y en ciertos casos en los cloroplastos en alta eficiencia de transformación ^19. La reducción de la lignina en el sistema vascular de la hoja de nervadura puede ser visualizado a través de microscopía electrónica de barrido (SEM) que es beneficioso para el examen de la topografía y la composición de las muestras.

En las plantas de maíz, dos de la reductasa de cinamoílo-CoA reductasa (ZmCCR1: X98083 y ZmCCR2: Y15069) se encontraron genes en el genoma del maíz ^20. Cinamoil-CoA reductasa cataliza la conversión de los ésteres hidroxicinamoil-CoA reductasa en aldehídos de cinamilo. Elegimos el gen ZmCCR1 para regular a la baja esta enzima debido a que el gen se expresa en todos los tejidos lignifying. Los 523 nucleótidos en el extremo 3 'del gen ZmCCR1 se eligieron para un dsRNAi construir porque las secuencias parecían sermás diversa en comparación con los de ZmCCR2. Por lo tanto, la construcción dsRNAi ataría precisamente sólo para ZmCCR1, evitando fuera del objetivo silenciar a ^21. Una construcción ZmCCR1_RNAi fue diseñado en el sistema de expresión citoplásmica ImpactVector1.1-tag (IV 1,1) que contiene el promotor específico de tejido verde, ribulosa-1, carboxilasa oxigenasa 5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO).

Para estudiar los efectos de la dsRNAi construir en plantas transgénicas, se cuantificó el contenido de lignina. La medición de lignina Klason (insoluble en ácido) es conocido por ser más precisa en comparación con los métodos de cuantificación de lignina detergente ácido que solubilizan algunos de la lignina ^22. Por lo tanto, la lignina Klason se midió en tallos de maíz transgénicas. Este procedimiento consiste en una hidrólisis ácida de dos pasos que convierte los carbohidratos poliméricos solubles en monosacáridos ^23. A continuación, la biomasa hidrolizada se fraccionó en ácido Materi soluble e insolubleALS y la lignina insoluble en ácido se midió de acuerdo con estudios anteriores ^23,24. Idealmente, el análisis de lignina debe incluir extracciones con agua y etanol antes de la etapa de hidrólisis, con el fin de eliminar los materiales solubles que pueden interferir con los resultados, y una combustión después de la hidrólisis del residuo de lignina para dar cuenta de cualquier ceniza presente en el residuo. Sin estos pasos, el contenido de lignina de la muestra podría ser inflado artificialmente. El método de integración global se presenta aquí, sin embargo, para nuestros experimentos hemos podido llevar a cabo estos dos pasos debido al pequeño volumen de material disponible para la prueba

También se analizaron otros dos componentes de la pared celular, la celulosa y la hemicelulosa en la lignina líneas de maíz transgénico-hacia abajo regulado. Se ha informado de que las plantas transgénicas que han sido regulados hacia abajo, ya sea en su fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) ^25, 4-cumarato: CoA ligasa (4CL) ^26, o una de cinamilodeshidrogenasa l alcohol (CAD) ²⁷ muestran un aumento de otros componentes estructurales de la pared celular. Como un primer paso en nuestros estudios, celulosa cristalina se midió utilizando el método Updegraff ^28. Este método fue ideado originalmente para la determinación de la celulosa en un gran número de bacterias celulolíticas y hongos. Brevemente, las existencias de maíz molidos fueron tratados con Updegraff reactivo (ácido acético: ácido nítrico: agua) para eliminar la hemicelulosa, lignina, y xylosans. La celulosa cristalina fue completamente hidrolizada en glucosa a través de Saeman hidrólisis mediante la adición de H ₂ SO _4. A continuación, la celulosa cristalina se ensayó usando el método colorimétrico de antrona ^29. Para verificar si se cambiaron el contenido de hemicelulosa, los extractos de monosacáridos de tallos molidos se hidroliza usando ácido trifluoroacético, derivatizados utilizando el método del acetato de alditol y se analizaron por cromatografía de gases (GC) ^30. Los procedimientos detallados para cel cristalinaanálisis de composición de contenido lulosa y de la matriz de polisacáridos se describen en Foster et al. (2010) ^31.

A continuación, describimos los procedimientos utilizados para la lignina baja regulación en el maíz a través de una tecnología de RNAi, la transformación por bombardeo de partículas, y el análisis de la lignina para la deconstrucción acelerada de maíz de biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables para los biocombustibles.

Protocol

1. Preparación de dsRNAi construcciones utilizadas para el descenso de regulación de ZmCCR1 Primers específicos de genes de diseño que incluyen sitios de enzimas de restricción necesarios para hacer una dsRNAi construir a ronda el gen ZmCCR1. Dos conjuntos de cebadores fueron diseñados para amplificar dos segmentos de fragmentos de ADNc ZmCCR1:. Un fragmento de 523 pb desde el nucleótido 748 hasta 1271, y un fragmento de 285 pb desde el nucleótido 986 hasta 1271 El ADNc …

Representative Results

Hemos demostrado una reducción en el contenido de lignina en las plantas de maíz a través de ARNi. El método de transformación por bombardeo de partículas produjo alrededor del 30% de eficiencia trnasformation. El silenciamiento de los genes de ZmCCR1 se observó consistentemente en generaciones T0-T2. Los transgénicos lignina reducida crecieron de manera similar a las plantas de maíz de tipo salvaje, excepto para la visualización de la coloración marrón en el medio de la hoja de la costilla, la cás…

Discussion

La accesibilidad de las celulasas microbianas para plantar polisacáridos de la pared celular depende en gran medida del grado en el que se asocian con polímeros fenólicos ^23. La tasa de conversión de biomasa lignocelulósica en azúcar fermentable se correlaciona negativamente con el contenido de lignina depositado en las paredes celulares de las plantas secondadry. Esta correlación se atribuye a las propiedades físicas de la lignina como hidrofobicidad ^24, la heterogeneidad química, y la au…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)