Lignin nedregulering av<em> Zea mays</em> Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

Summary

En dobbelttrådet RNA interferens (dsRNAi) teknikken er ansatt for å ned-regulere mais cinnamoylforbindelser koenzym A-reduktase (ZmCCR1) genet til lavere plante lignin innhold. Lignin nedregulering av celleveggen blir visualisert ved mikroskopiske analyser og kvantifiseres ved Klason metoden. Sammensetningsendringer hemicellulose og krystallinsk cellulose blir analysert.

Abstract

For å lette bruken av lignocelluloseholdig biomasse som et alternativ bioenergi ressurs, under biologiske omvandlingsprosesser, er en forbehandling trinn som trengs for å åpne opp strukturen av plantecelleveggen, noe som øker tilgjengeligheten av celleveggen karbohydrater. Lignin, en polyfenoliske materiale som finnes i mange cellevegg-typer, er kjent for å være en betydelig hindring for enzym tilgang. Reduksjon i lignin-innhold til et nivå som ikke forstyrrer den strukturelle integriteten og forsvarssystemet i anlegget kan være et verdifullt skritt for å redusere kostnadene ved produksjon av bioetanol. I denne studien, har vi genetisk nedregulert en av lignin-biosyntese-relaterte gener, cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase (ZmCCR1) via en dobbelt-trådet RNA-interferens teknikk. Den ZmCCR1_RNAi konstrukt ble integrert i genomet ved hjelp av mais partikkel bombardement metoden. Transgene maisplanter vokste normalt i forhold til villtype kontrollanlegg uten iterfering med biomassevekst eller forsvarsmekanismer, med unntak av visning av brun-farge i transgene planter blad midten av ribbeina, skall og stilker. De mikroskopiske analyser, i forbindelse med den histologisk assay viste at blad sclerenchyma fibre ble tynnet men strukturen og størrelsen på andre viktige vaskulære system komponenter ble ikke forandret. Det lignin-innholdet i den transgene mais ble redusert med 7 til 8,7%, ble den krystallinske cellulose-innhold økes som reaksjon på lignin reduksjon, og hemicelluloser forble uendret. Analysene kan tyde på at karbonstrømmen kan ha blitt flyttet fra lignin biosyntese til cellulose biosyntese. Denne artikkelen delineates Fremgangsmåtene anvendt til å ned-regulere lignin-innholdet i mais via RNAi-teknologi, og celleveggen komposisjonelle analyser anvendes for å kontrollere effekten av endringer av celleveggstrukturen.

Introduction

I produksjon av biodrivstoff fra lignocelluloseholdig biomasse er meget ønskelig på grunn av den foreliggende mengde i US ^1, og i tilfelle av en bærekraftig innhøstingen av rester jord-og skogbruk, evnen til å konkurrere direkte til dyrket mark anvendes for mat-og dyrefor-produksjon. Imidlertid, i motsetning til mais korn, som er hovedkilden for biodrivstoff tiden genereres i USA, lignocelluloseholdige materialer er betydelig mer komplisert og vanskelig å bryte ned. I tillegg til det langkjedede karbohydrater, cellulose og hemicellulose, som er de viktigste kilder til sukker ved gjæring av lignocelluloseholdige materialer, mange typer av plantecellevegger også inneholder lignin, et styrene polymer som gir styrke, forsvar mot patogene angrep, og hydrofobisitet til celleveggene. Mens nødvendige for plantevekst og overlevelse, lignin presenterer også en betydelig hindring for den vellykkede enzymatisk omdannelse av cellulose og hemicellutape mot løselige sukker. Materialer med høy lignin innholdet er generelt mindre ønskelig materialer for både biodrivstoff (gjennom biologisk konverterings pathways) og masse-og papirindustrien på grunn av de negative virkninger på prosesseringskarakteristika og produktkvalitet. Derfor kan genetisk manipulering av plantemateriale for lignin reduksjon på et nivå som ikke forstyrrer med crop strukturell styrke og forsvarssystemer være viktig for reduksjon av produksjonskostnader for både lignocellulose biobrensel og masse-og papirindustrien.

I mais (Zea Mays), er lignin kovalent kryssbundet til hemicellulose i den primære celleveggen via ferulate og diferulate broer ^to. Det lignin-hemicellulose-komplekset bindes til cellulose mikrofibriller gjennom hydrogenbindinger, som danner et kompleks matrise som confers integritet og styrke til den sekundære celleveggen. Den mekaniske styrken av plantecellevegger er i stor grad bestemt av hvilken type lignin subenheter ^3-5. I tidligere studier har endre proporsjonene av lignin subenheter vist noen klar trend på enzymatisk fordøyelighet ^6-11. Men reduksjon i lignin-innhold generelt viser en forbedring i konverteringer ^12,13 og kan være en nøkkel til å øke fordøyeligheten av plantemateriale av hydrolytiske enzymer, inkludert endocellulases, cellobiohydrolases og β-glucosidases ^14.

Genteknologi for å regulere uttrykket nivået av vitnemål har blitt grundig praktisert å forbedre avlingstrekk. Avanserte teknikker, inkludert anti-sense ¹⁵ og co-undertrykkelse ¹⁶ teknologier, muliggjøre effektiv nedregulering av målet gener. Komplett genet knock-out har også blitt oppnådd ved hjelp genet konstruerer koder intron-skjøtes RNA med en hårnål struktur ^17. Videre, en dobbelttrådet RNA interferens (dsRNAi) teknikk, dvs. en kraftig og effektiv genuttrykk mediator som fungerer ved enten å målrette transkripsjon nedbrytning eller oversettelses undertrykkelse, gir en potent middel for å indusere en lang rekke undertrykkelse virkninger på mRNA-target ^18.. Genet stanse teknikker viser flere begrensninger. Disse teknikkene ikke nøyaktig regulere nivået av transkripsjon og det kan føre til uventede Silencing effekter på andre homologe gener.

I denne fremgangsmåten anvendes vi partikkel bombardement for å bære dsRNAi konstruerer inn i mais genom. Til dags dato har et stort utvalg av plantearter blitt forvandlet ved hjelp partikkel bombardement, Agrobacterium mediert transformasjon, elektroporering, og mikroinjeksjon metoder. I mais genetisk transformasjon, er partikkel-bombardement-metoden fordelaktig fremfor alle de andre metodene, fordi det er det mest effektive. Partikkel bombardement er ikke avhengig av bakterier, slik at metoden er fritt for biologiske begrensninger som for eksempel størrelsen av genet, arter av genet ellerigin eller planten genotype. Den fysiske transgenet leveringssystem muliggjør høy molekylvekt-DNA og multiple gener for å bli introdusert inn i plante genomer, og i visse tilfeller i kloroplaster med høy transformasjonseffektivitet ^19.. Den lignin reduksjon i det vaskulære system av bladet midten av ribben kan visualiseres via scanning elektronmikroskopi (SEM) som er gunstig for behandlingen av topografi og sammensetningen av prøvene.

I maisplanter, to av cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase (ZmCCR1: X98083 og ZmCCR2: Y15069) gener ble funnet i maisgenomet ^20. Cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase katalyserer omdannelsen av hydroxycinnamoyl-CoA estere i cinnamyl aldehyder. Vi valgte ZmCCR1 genet for å ned-regulere dette enzymet, fordi genet blir uttrykt i alle lignifying vev. De 523 nukleotider ved 3'-terminus av ZmCCR1-genet ble valgt ut for en dsRNAi konstruere fordi de sekvenser som syntes å væremer mangfoldig i forhold til de av ZmCCR2. Dermed vil den dsRNAi konstruere presist binde bare til ZmCCR1, unngå off-target stanse ^21. En ZmCCR1_RNAi konstruere ble manipulert inn i cytoplasma uttrykk system ImpactVector1.1-tag (IV 1,1) som inneholder den grønne vev promoter, ribulose-bifosfatase-karboksylase/oksygenase-proteinet-1, 5-bisfosfat karboksylase oksygenase (Rubisco).

For å studere effektene av den dsRNAi konstruere den transgene planter ble lignininnhold kvantifisert. Den Klason (syre-uløselig) lignin-måling er kjent for å være mer nøyaktig enn i de sure vaskemiddel lignin kvantifisering metoder som solubilisere noe av ligninet ^22.. Derfor ble Klason lignin målt i transgene maisstengler. Denne fremgangsmåten består av en to-trinns syrehydrolyse som omdanner polymere karbohydrater til monosakkarider ²³ oppløselige. Den hydrolysert biomasse ble deretter fraksjonert i syre løselig og uløselig materialerals og syren uløselig lignin ble målt i henhold til tidligere studier ^23,24. Ideelt sett bør lignin-analyse omfatter ekstraksjoner med vann og etanol før hydrolyse-trinnet, for vannløselige materialer som kan påvirke resultatene for å fjerne, og en post-hydrolyse forbrenning av ligninet residuet å registrere eventuell aske som finnes i residuet. Uten disse trinn, kan lignin-innholdet i prøven økes kunstig. Den fullstendige fremgangsmåte er presentert her, men for våre eksperimenter var vi ute av stand til å utføre begge disse trinn på grunn av det lille volum av materiale som er tilgjengelig for testing

To andre cellevegg komponenter, cellulose og hemicellulose ble også analysert i lignin nedregulert transgen maislinjer. Det har blitt rapportert at transgene planter som har blitt nedregulert i enten deres fenylalanin ammoniakk-lyase (PAL) ^25, 4-coumarate: CoA ligase (4CL) ^26, eller cinnamyl enlcohol dehydrogenase (CAD) ²⁷ viser en økning i andre cellevegg-konstruksjonsdeler. Som et første skritt i våre studier, ble krystallinsk cellulose målt ved hjelp av Updegraff metode ^28. Denne fremgangsmåten ble opprinnelig utviklet for bestemmelse av cellulose i et stort antall cellulolytic bakterier og sopp. Kort sagt ble de malte mais stocks behandlet med Updegraff reagens (eddiksyre: salpetersyre: vann) for å fjerne hemicellulose, lignin og xylosans. Den krystallinsk cellulose ble fullstendig hydrolysert til glukose via Saeman hydrolyse ved å legge H ₂ SO _4. Det krystallinske cellulose ble deretter analysert ved hjelp av den kolorimetriske metoden anthrone ^29.. For å kontrollere om den hemicellulose innholdet ble endret, ble monosakkarid ekstrakter fra malte stilker hydrolysert ved anvendelse av trifluoreddiksyre, derivatisert ved hjelp av alditol-acetat-metoden, og deretter analysert ved gasskromatografi (GC) ^30. De detaljerte prosedyrer for krystallinsk cellose innhold og matrise polysakkarider sammensetning analyser er beskrevet i Foster et al. (2010) ^31.

Her beskriver vi de prosedyrer som brukes for lignin nedregulering i mais via en RNAi teknologi, partikkel bombardement transformasjon, og lignin analyse for akselerert dekonstruksjon av mais lignocellulose biomasse til gjæringsdyktig sukker for biodrivstoff.

Protocol

En. Utarbeidelse av dsRNAi konstruerer brukt for nedregulering av ZmCCR1 Design genet spesifikke primere inkludert nødvendige restriksjonsenzym nettsteder for å lage en dsRNAi konstruere til knock-out på ZmCCR1 genet. To primer settene ble designet for å forsterke to fragment segmenter av ZmCCR1 cDNA:. En 523 bp fragment fra nukleotid 748-1271, og en 285 bp fragment fra nukleotid 986-1271 The ZmCCR1 cDNA ble levert fra Arizona Genome Institute (AGI). Ytterligere detalje…

Representative Results

Vi har vist en reduksjon i lignin-innholdet i maisplanter via RNAi. Partikkel bombardement transformasjon metoden ga rundt 30% trnasformation effektivitet. Genet stanse av ZmCCR1 ble konsekvent observert i T0-T2 generasjoner. Lignin redusert transgenics vokste på samme måte som villtype maisplanter unntatt for visning brun farge i blad midten av ribben, skrelle, og stammen. Histologisk analyse har vist at de mutante linjer utviser en signifikant reduksjon i celleveggtykkelse av de sclerenchyma fibrene i mais …

Discussion

Tilgjengeligheten av mikrobielle cellulaser å plante cellevegg polysakkarider er i stor grad avhengig av i hvilken grad de er forbundet med fenoliske polymerer ^23. Konverteringskursen fra lignocellulose biomasse til gjæringsdyktig sukker er negativt korrelert med lignin innhold deponert i plante secondadry celleveggene. Denne korrelasjon er henført til de fysikalske egenskaper av lignin slik som hydrofobisitet ^24, kjemisk heterogenitet, og fraværet av vanlig hydrolyserbar intermonomeric leddene…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)