Lignine régulation à la baisse de<em> Zea mays</em> Via dsRNAi et Klason lignine analyse

Summary

Un double interférence ARN brin (dsRNAi) technique est employée pour réguler à la baisse la coenzyme maïs cinnamoyl A réductase (ZmCCR1) gène à faible teneur en lignine des plantes. La lignine régulation à la baisse à partir de la paroi cellulaire est visualisée par des analyses microscopiques et quantifiée par la méthode Klason. Changements dans la composition de l'hémicellulose et la cellulose cristalline sont analysés.

Abstract

Pour faciliter l'utilisation de la biomasse ligno-cellulosique en tant que ressource de bioénergie alternatif, pendant les processus de conversion biologique, une étape de prétraitement est nécessaire pour ouvrir la structure de la paroi cellulaire de la plante, en augmentant l'accessibilité des hydrates de carbone de la paroi cellulaire. La lignine, une matière polyphénolique présente dans de nombreux types de parois cellulaires, est connu pour être un obstacle important à l'accès de l'enzyme. Réduction de la teneur en lignine à un niveau qui n'interfère pas avec le système de l'intégrité structurelle et la défense de la plante peut être une étape importante pour réduire les coûts de la production de bioéthanol. Dans cette étude, nous avons génétiquement régulé à la baisse l'un des gènes liés à la biosynthèse de la lignine-,-cinnamoyl CoA réductase (ZmCCR1) par l'intermédiaire d'une technique d'interférence de l'ARN double brin. Le produit d'assemblage ZmCCR1_RNAi a été intégré dans le génome de maïs en utilisant le procédé de bombardement de particules. Plants de maïs transgéniques ont augmenté normalement par rapport à des plantes témoins de type sauvage sans enterfering à la croissance de la biomasse ou des mécanismes de défense, à l'exception de l'affichage de brun-coloration dans les plantes feuilles milieu des côtes transgéniques, les balles et les tiges. Les analyses microscopiques, en conjonction avec le test histologique, ont révélé que les fibres de sclérenchyme de feuilles ont été éclaircis mais la structure et la taille des autres principaux composants du système vasculaire n'a pas été modifiée. La teneur en lignine dans le maïs transgénique a été réduite de 7 à 8,7%, la teneur en cellulose cristalline a été augmenté en réponse à la réduction de la lignine, des hémicelluloses et est restée inchangée. Les analyses peuvent indiquer que le flux de carbone aurait été déplacé de la biosynthèse de la lignine de la cellulose biosynthèse. Cet article définit les procédures utilisées pour réguler à la baisse la teneur en lignine dans le maïs via la technologie ARNi, et la composition de la paroi cellulaire des analyses permet de vérifier l'effet des modifications sur la structure de la paroi cellulaire.

Introduction

La production de biocarburants à partir de biomasse lignocellulosique est hautement souhaitable en raison de son abondance actuelle aux États-Unis ^1, et dans le cas de la récolte durable des résidus agricoles et forestiers, la capacité de ne pas concurrencer directement les terres cultivées utilisées pour l'alimentation animale et la production d'aliments. Cependant, contrairement à grains de maïs, qui est la principale source de biocarburant a généré aux Etats-Unis, les matériaux lignocellulosiques sont beaucoup plus complexes et difficiles à briser. En plus de la hydrates de carbone à longue chaîne, de la cellulose et de l'hémicellulose, qui sont les principales sources de sucres pendant la fermentation de matières ligno-cellulosiques, de nombreux types de parois de cellules végétales contiennent également de la lignine, un polymère phénylpropanoïdes qui fournit la force, à la défense contre une attaque pathogène, et l'hydrophobicité de parois cellulaires. Alors que nécessaire pour la croissance des plantes et de la survie, de la lignine présente également un obstacle important à la conversion enzymatique de la cellulose avec succès et hemicelluperdre de sucres solubles. Matériaux à haute teneur en lignine sont généralement des matériaux moins souhaitables à la fois pour le biocarburant (par des voies de conversion biologique) et les industries de pâtes et papiers en raison des impacts négatifs sur les caractéristiques de traitement et la qualité des produits. Par conséquent, la manipulation génétique du matériel végétal pour la réduction de la lignine à un niveau qui n'interfère pas avec la culture et la résistance structurelle des systèmes de défense pourrait être important pour la réduction des coûts de production à la fois pour le biocarburant lignocellulosique et les industries de pâtes et papiers.

Dans le maïs (Zea mays), de la lignine est réticulé de manière covalente à l'hémicellulose dans la paroi de la cellule primaire par l'intermédiaire de ponts férulate et diferulate ^2. Le complexe lignine-hémicellulose se lie à des microfibrilles de cellulose à travers des liaisons hydrogène, la formation d'une matrice complexe qui confère une intégrité et une résistance à la paroi cellulaire secondaire. La résistance mécanique des parois cellulaires de la plante est largement déterminée par le type de lignin sous-unités ^3-5. Dans des études antérieures, en modifiant les proportions de sous-unités de la lignine n'a montré aucune tendance claire sur la digestibilité enzymatique ^6-11. Cependant, les réductions de la teneur en lignine présentent généralement une amélioration de la conversion et ^12,13 peuvent être une clé pour augmenter la digestibilité de la matière végétale par des enzymes hydrolytiques incluant endocellulases, cellobiohydrolases, β-glucosidases et ^14.

Le génie génétique pour réguler le niveau de transcrits d'expression a été largement pratiquée à améliorer les caractères des cultures. Des techniques de pointe, y compris les anti-sens ¹⁵ et co-suppression ^{de 16} technologies, permettent une régulation efficace de gènes cibles. Gène complet knock-out ont également été réalisés en utilisant des constructions de gènes codant pour des ARN d'intron-épissé avec une structure en épingle à cheveux ^17. Par ailleurs, un double brin d'ARN interférence (dsRNAi) de la technique, c'est à dire un support d'expression de gène efficace et puissantteur qui fonctionne soit en ciblant la dégradation de transcription ou de traduction répression, fournit un moyen puissant pour induire un large éventail d'effets de suppression sur l'ARNm cible ^18. Techniques Gene silencing montrent plusieurs limites. Ces techniques ne règlent pas avec précision le niveau de la transcription et il pourrait provoquer des effets inattendus sur d'autres silencieux des gènes homologues.

Dans cette méthode, nous avons utilisé le bombardement de particules pour effectuer la dsRNAi construit dans le génome du maïs. À ce jour, une vaste gamme d'espèces de plantes ont été transformés avec succès en utilisant un bombardement de particules, Agrobacterium transformation médiation, l'électroporation, et les méthodes de micro-injection. Dans la transformation génétique du maïs, le procédé de bombardement de particules est avantageuse par rapport à toutes les autres méthodes car il est le plus efficace. le bombardement de particules ne dépend pas de bactéries, de sorte que le procédé est exempt de contraintes biologiques tels que la taille des espèces de gènes, le gène ouIgin, ou le génotype de la plante. Le système de délivrance d'un transgène physique permet à l'ADN de haut poids moléculaire et de multiples gènes à introduire dans le génome des plantes et dans certains cas dans les chloroplastes à haute efficacité de la transformation ^19. La réduction de la lignine dans le système vasculaire de la nervure centrale des feuilles peut être visualisé par microscopie électronique à balayage (SEM) qui est bénéfique pour l'examen de la topographie et la composition des échantillons.

Dans les plants de maïs, de la réductase de deux cinnamoyl-CoA (ZmCCR1: X98083 et ZmCCR2: Y15069) gènes ont été trouvés dans le génome du maïs ^20. Cinnamoyle-CoA reductase catalyse la conversion de l'ester hydroxycinnamoyl-CoA en aldéhydes cinnamyliques. Nous avons choisi le gène ZmCCR1 à réguler à la baisse cette enzyme parce que le gène est exprimé dans tous les tissus lignifying. Les 523 nucleotides à l'extrémité 3 'du gène ZmCCR1 ont été choisis pour la construction d'un dsRNAi parce que les séquences ont semblé êtreplus diversifiée par rapport à ceux de ZmCCR2. Ainsi, la construction dsRNAi lierait précisément qu'à ZmCCR1, évitant hors cible au silence ^21. Produit d'assemblage ZmCCR1_RNAi a été conçu dans le système d'expression cytoplasmique ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) contenant le vert promoteur spécifique de tissu, le ribulose-1, 5 carboxylase oxygénase-bisphosphate (RuBisCO).

Pour étudier les effets de la dsRNAi construire sur des plantes transgéniques, la teneur en lignine a été quantifiée. Le Klason (insolubles dans l'acide) mesure de la lignine est connu pour être plus précis par rapport à des méthodes de quantification de la lignine détergent acide qui solubilisent une partie de la lignine ^22. Par conséquent, la lignine Klason a été mesurée dans les tiges de maïs transgéniques. Ce procédé consiste en une hydrolyse acide en deux étapes qui permet de convertir des glucides polymères solubles dans ²³ monosaccharides. La biomasse hydrolysée a ensuite été fractionné en materi solubles et insolubles acidesal et la lignine insoluble de l'acide a été mesurée d'après des études antérieures ^23,24. Idéalement, l'analyse de la lignine doit comprendre extractions avec de l'eau et de l'éthanol avant l'étape d'hydrolyse, afin d'éliminer les matières solubles qui peuvent interférer avec les résultats, et une combustion post-hydrolyse du résidu de lignine pour tenir compte de toutes les cendres présentes dans le résidu. Sans ces mesures, la teneur en lignine de l'échantillon pourrait être gonflé artificiellement. La méthode complète est présentée ici, mais pour nos expériences, nous n'avons pas pu effectuer ces deux étapes en raison du faible volume de matériel disponible pour les tests

Deux autres composants de la paroi cellulaire, la cellulose et l'hémicellulose ont également été analysés dans la lignine de lignes régulée à la baisse de maïs transgénique. Il a été rapporté que les plantes transgéniques qui ont été régulés à la baisse dans les deux leur phénylalanine ammoniac-lyase (PAL) ^25, 4 coumarate: CoA ligase (4CL) ^26, ou un cinnamyliquelcohol déshydrogénase (CAD) ²⁷ montrent une augmentation des autres éléments structurels de la paroi cellulaire. Comme première étape dans nos études, la cellulose cristalline a été mesuré en utilisant la méthode Updegraff ^28. Cette méthode a été initialement conçu pour la détermination de la cellulose dans un grand nombre de bactéries et de champignons cellulolytiques. En bref, les stocks de maïs broyées ont été traités avec Updegraff réactif (acide acétique: acide nitrique: l'eau) pour enlever l'hémicellulose, la lignine, et xylosans. La cellulose cristalline a été complètement hydrolysé en glucose via Saeman hydrolyse par addition de H ₂ SO _4. La cellulose cristalline a ensuite été testée en utilisant la méthode colorimétrique à l'anthrone ^29. Pour vérifier si le contenu d'hémicellulose ont été modifiées, les extraits de monosaccharides à partir de tiges broyées ont été hydrolysés à l'aide de l'acide trifluoroacétique, transformés en dérivés en utilisant la méthode de l'acétate d'alditol et ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse (GC) ^30. Les procédures détaillées pour cel cristallineLes analyses de composition et de matrice contenu lulose polysaccharides sont décrits dans Foster et al. (2010) ^31.

Ici, nous décrivons les méthodes utilisées pour la lignine régulation à la baisse dans le maïs par une technologie ARNi, particule transformation de bombardement, et l'analyse de la lignine pour la déconstruction accélérée de maïs biomasse lignocellulosique en sucres fermentescibles pour les biocarburants.

Protocol

1. Préparation de dsRNAi constructions utilisées pour la régulation à la baisse de ZmCCR1 amorces spécifiques du gène de conception, y compris nécessaires sites d'enzymes de restriction pour faire un dsRNAi construire de knock-out du gène ZmCCR1. Deux jeux d'amorces ont été conçues pour amplifier deux segments de fragments de ZmCCR1 ADNc:. Un fragment de 523 pb du nucléotide 748 à 1271, et un pb fragment 285 de nucléotides 986-1271 Le ZmCCR1 ADNc a ét…

Representative Results

Nous avons mis en évidence une réduction de la teneur en lignine dans des plants de maïs par l'ARNi. Procédé de transformation d'un bombardement de particules a donné environ 30% d'efficacité de trnasformation. Le silence des gènes de ZmCCR1 a été systématiquement observée dans les générations T0-T2. Les transgéniques de lignine réduit ont augmenté de manière similaire à des plants de maïs de type sauvage, sauf pour l'affichage de coloration brune dans la feuille mi-côte, ba…

Discussion

L'accessibilité des cellulases microbiennes pour planter des polysaccharides de la paroi cellulaire est largement dépendante de la mesure dans laquelle ils sont associés à des polymères phénoliques ^23. Le taux de biomasse lignocellulosique de conversion fermentescibles sucre est corrélée négativement avec le contenu de la lignine déposé dans secondadry parois cellulaires végétales. Cette corrélation est attribuée aux propriétés physiques de la lignine tels que l'hydrophobie ^24,</…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)