アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em>緑膿菌</em使用>ミニ<em> himar1</em>マリナートランスポゾンによる突然変異誘発
Summary
ここでは、画面に高密度の挿入変異体ライブラリーを生成するためのミニhimar1マリナートランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述し隔離し、原型緑膿菌 PAO1株における新規アルギン酸レギュレータを識別します。
Abstract
緑膿菌は、汎用性の高い代謝機能を持つグラム陰性、環境細菌である。P.緑膿菌は、嚢胞性線維症（CF）患者における慢性肺感染症を確立日和見病原菌である。またmucoidyとして知られているアルギン酸と呼ばれる莢膜多糖の過剰産生は、抗生物質、化学療法および宿主防御に浮遊細胞よりも抵抗性がある粘液状のバイオフィルムの形成を促進する。また、粘液性の表現型への非ムコイドからの変換は、CFにおける慢性感染の発症のための臨床マーカーである。 P.によるアルギン酸塩過剰生産緑膿菌は重く細胞エネルギーを課税吸エルゴン過程である。したがって、アルギン酸塩生産はPに高度に規制されている緑膿菌 。より良いアルギン酸調節を理解するために、我々は、新規なアルギン酸塩レギュレータの同定のためのミニhimar1トランスポゾン突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述原型PAO1株におけるS。手順は、2つの基本ステップで構成されています。まず、ホストEからミニhimar1トランスポゾン（PFAC）に転送受信者P.に大腸菌 SM10/λpirゲンタマイシンを補充したシュードモナス分離寒天プレート上で選択した高密度の挿入変異体ライブラリーを作成するための共役二親を介して緑膿菌 PAO1。第二に、我々は、スクリーニングおよびゲンタマイシンカセットおよびDNA配列決定から外向きDNAプライマーを用いた逆PCRを介して挿入部位をマッピングするムコイドのコロニーを単離した。 （AlgTは、22を σ）は、野生型ムカマスターアルギン酸レギュレータAlgU抗シグマ因子ムカをコードするPAO1株で、このプロトコルを使用して、我々は2つの新規アルギン酸レギュレータを特定し、mucE（PA4033）とkinB（PA5484） 。このハイスループット突然変異誘発プロトコルは、結腸の変化を引き起こす他の病原性関連遺伝子の同定のために修飾することができるNY形態。
Introduction
アルギン酸塩を過剰にする日和見、グラム陰性病原体緑膿菌の能力は、バイオフィルムを確立する能力において主要な因子である。アルギン酸塩の過剰産生は、多くの場合、mucoidyと呼ばれる表現型である。嚢胞性線維症（CF）に罹患した個体の痰からムコイドのコロニーの単離は、慢性感染の指標であり、直接的に患者の健康1における全体的な減少と関連している。現在、それは理解されるP.におけるアルギン酸塩の調節および生産緑膿菌は、主に2つのオペロンで行われます。全体のアルギン酸塩ポリマーの合成と輸出を担当している（ 藻類 – ALG8 – alg44 – algK – 代数 – algG – algX – algL – algI – algJ – – algF algD）最初は、12の遺伝子が含まれているアルギン酸生合成オペロン、である外environmeにペリプラズムNT 2-5。二オペロンは遺伝子のクラスター代替シグマ因子algU / Tで始まり、 ムカ、mucB、およびMUCDと続いている。 mucAB-Dはアルギン酸塩の生産6-8の負の調節因子として分類されている間AlgU / Tは、正の調節因子である。さらに、異化代謝産物抑制制御、キナーゼ活性（KinB）と内タンパク質分解によってそのようなAlgB、AlgQ、AlgR、およびRpoNだけでなく、転写後および翻訳後修飾のような転写調節因子も、アルギン酸塩に関与することが示されているレギュレーション9月14日 。
PFACとして知られているミニhimar1トランスポゾンベクターは、もともとハーバード大学医学部15博士Mekalanos '研究室で作成されました。 PFACプラスミドは2 27 BPSの逆方向反復と中央のゲンタマイシン耐性カセット（aacC1：534 BP）に挟まれた転移因子で構成され、hyperactをコードする遺伝子IVEはマリナートランスポザーゼ 16、および遺伝子をコードするβ-ラクタマーゼ（BLA）（ 図1）。 DQ366300 13：PFACの転移因子についての配列情報は、GenBankアクセッション番号で入手できます。 PFACにおいて、インバースPCRを用いて染色体挿入部位の同定のために使用されるaacC1遺伝子の背後にある複数のクローニング部位（MCS）が存在する。ミニhimar1トランスポゾンを使用する場合の1つの主要な利点は、特定の宿主因子を移調（誘発）のために必要ありませんです。また、Pのゲノムで発見TAジヌクレオチド挿入部位の高い存在があります緑膿菌 。それぞれのゲノムを、例えば、TAジヌクレオチド挿入部位はPAO1に94404と100229回発生（6264404 BPS、GenBankアクセッション番号NC_002516.2）とPA14（ジェンバンクアクセス番号NC_008463 6537648 BPS）。なぜなら、ゲノム中のTAジヌクレオチドの豊富さ、ミニhimar1 </em>トランスポゾンは、毒性遺伝子の分析および高度に調節される遺伝子に特に適している高密度のランダム突然変異誘発を引き起こすことができる。理論的には、ミニhimar1トランスポゾンは、Pのゲノム内の任意の非必須遺伝子に挿入することができます緑膿菌 。これはPAO1ゲノムにおけるオープンリーディングフレームあたり約18のTA挿入部位を提供しています。
ここでは、P.中mucoidyの新規制御因子を特定するために、ミニhimar1トランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述緑膿菌 。具体的には、我々はbiparentally Eからミニhimar1トランスポゾンを含むPFACベクトル共役非ムコイド栄養PAO1株に大腸菌 SM10/λpir。トランスポゾンは、ゲノムに組み込まれた後、レシピエント株は、 大腸菌の増殖を阻害するトリクロサンを含有する、シュードモナス分離寒天（PIA）上で培養する大腸菌 。このように、の変異体のライブラリー<em> P.緑膿菌は、ゲンタマイシンおよびムコイド表現型の存在を補充したPIAプレート上の増殖により選択することができる。真のトランスポゾン媒介統合変異対ゲンタマイシン耐性およびカルベニシリン感受性表現型を持つことになります、注意してください。本研究では、PAO1の約8万挿入変異体は、4つの別々の動詞によって単離した。次に、ムコイド分離株についてスクリーニングし、制限酵素消化、ライゲーション、逆PCRにより挿入部位を決定した。私たちは、ゲノム当たりの挿入の数を確認するためのプローブとしてゲンタマイシン耐性カセットを用いてサザンブロット解析を行った。我々は、このプロトコルを使用してコンジュゲート当たりの得た変異体の90％以上がゲノム中にhimar1の単一コピーを持っていたし、ゲンタマイシン耐性およびカルベニシリンに敏感な表現型を示していると判断。 32粘液性分離株の合計が同定された、そのうちの22は、Pの異なる遺伝子座にマップされた緑膿菌 PAO1染色体。挿入このレートは、アルギン酸塩過剰生産のいくつかの新規制御因子を特定するために十分なカバレッジを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、これらの変化と他のシュードモナス種に使用することができることに留意することが重要である：P.インキュベートフルオレッセンスおよびP. 30℃でプチダ 、およびP. 42℃でのストチェリ ; P. stuzeriはゲンタマイシンの150μg/ mLのを追加したLBプレート上で培養しなければならない。ステップ1.11、Pにスタッツェリ細胞をLB5…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、生物医学研究の卓越性のためのウェストバージニア州のアイデアネットワークにアメリカ航空宇宙局ウェストバージニアスペースグラントコンソーシアム（NASA WVSGC）、嚢胞性線維症財団（CFF-YU11G0）およびNIH P20RR016477とP20GM103434によってサポートされていました。我々は、この作品について技術的な支援のためにVonya M·アイジンガーに感謝します。
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O’Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
