Identifikation af nye gener forbundet med Alginat Produktion i<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Brug Mini-<em> Himar1</em> Mariner Transposon-medieret mutagenese

Summary

Her beskriver vi en protokol ved hjælp af mini-himar1 mariner transposon-medieret mutagenese for at generere et high-density indsættelse mutantbibliotek til skærm, isolere og identificere nye alginat lovgivere i det prototypiske Pseudomonas aeruginosa stamme PAO1.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa er en Gram-negativ, miljømæssig bakterie med alsidige metaboliske kapacitet. P. aeruginosa er en opportunistisk bakteriel patogen, der etablerer kroniske pulmonare infektioner hos patienter med cystisk fibrose (CF). Overproduktion af et kapselpolysaccharid kaldet alginat, også kendt som mucoidy, fremmer dannelsen af ​​slimet biofilm, der er mere modstandsdygtig end planktoniske celler til antibiotisk kemoterapi og værtsforsvar. Derudover konvertering fra nonmucoid til mucoid fænotype er en klinisk markør for indtræden af ​​kronisk infektion i CF. Alginat overproduktion af P. aeruginosa er en endergonic proces, som i høj grad skatter cellulær energi. Derfor er alginat produktion stærkt reguleret i P. aeruginosa. For bedre at forstå alginat regulering beskriver vi en protokol ved hjælp af mini-himar1 transposon mutagenese til identifikation af nye alginat regulators i en prototypisk stamme PAO1. Proceduren består af to grundlæggende skridt. Først overførte vi mini-himar1 transposonen (pFAC) fra vært E. coli SM10/λpir i recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugation til at skabe et high-density indsættelse mutantbibliotek, som blev udvalgt på Pseudomonas isolation agarplader suppleret med gentamycin. For det andet, vi screenet og isolerede mucoide kolonier at kortlægge insertionsstedet gennem omvendt PCR ved hjælp af DNA-primere, der peger udad fra gentamycin kassette og DNA-sekventering. Ved hjælp af denne protokol, har vi identificeret to nye alginat regulatorer, mucE (PA4033) og kinB (PA5484) i stammen PAO1 med en vildtype Muca koder anti-sigma faktor Muca til master alginat regulator AlgU (ALGT, σ ²²⁾ . Denne high-throughput mutagenese protokol kan modificeres til identifikation af andre virulens-gener, der forårsager ændringer i colony morfologi.

Introduction

Evne opportunistisk, Gram-negative patogener Pseudomonas aeruginosa at overproducere alginat er en vigtig faktor i sin evne til at etablere en biofilm. Overproduktion af alginat er en fænotype, der ofte omtales som mucoidy. Isoleringen af mucoide kolonier fra sputa af personer ramt af cystisk fibrose (CF) er tegn på en kronisk infektion, og er direkte forbundet med et samlet fald i patientens helbred ^1. I øjeblikket er det underforstået, at regulering og produktion af alginat i P. aeruginosa forekommer primært på to operoner. Den første er den alginat biosyntetiske operon, der indeholder 12 gener (algD – alg8 – alg44 – algK – Alge – algG – algX – algL – ALGI – algJ – algF – Alga), som er ansvarlige for syntesen og eksport af alginat polymer tværs periplasmaet til det ekstracellulære environment ^2-5. Den anden operon er en klynge af gener, der begynder med den alternative sigma faktor algU / T og fortsatte med Muca, mucB og mucD. AlgU / T er en positiv regulator, mens mucAB-D er klassificeret som negative regulatorer af alginat produktion ^6-8. Derudover har også vist, transkriptionelle regulatorer, såsom ALGB, AlgQ, AlgR og RpoN, samt post-transkriptionel og post-translationel modifikation af katabolitrepression kontrol kinaseaktivitet (KinB) og intramembrane proteolyse for at være involveret i alginat regel ^9-14.

Mini-himar1 transposon vektor kaldet pFAC blev oprindeligt skabt i Dr. Mekalanos 'laboratorium på Harvard Medical School ^15. Den pFAC plasmid består af et transposerbart element flankeret af to inverterede gentagelser af 27 bps og en gentamycin modstand kassette i midten (aacC1: 534 bp), et gen kodende for hyperactive mariner transposasen ^16, og et gen, der koder for β-lactamase (bla) (figur 1). Sekvens oplysninger til flytbare element af pFAC er tilgængelig på GenBank accession number: DQ366300 ^13.. I pFAC er der et multipelt kloningssted bag aacC1 gen, der anvendes til identifikation af kromosomale insertionssted hjælp invers PCR (MCS). En stor fordel med hjælp af mini-himar1 transposonen er ingen specifikke værtsfaktorer er nødvendige for gennemførelse (mutagenese). Desuden er der stor overflod af TA dinukleotiddimererne indsættelsessteder findes i hele genomet af P. aeruginosa. For eksempel TA dinukleotid indsættelsessteder opstår 94.404 og 100.229 gange i PAO1 (6.264.404 bps, Genbank-nummer NC_002516.2) og PA14 (6.537.648 bps, GenBank adgangsnummer NC_008463) genomer, hhv. På grund af den overflod af TA dinukleotid i genomet, mini-himar1 </em> Transposon kan forårsage høj densitet og vilkårlig mutagenese, som er særlig egnet til analyse af sygdomsfremkaldende gener og gener, der er stærkt regulerede. Teoretisk set kan mini-himar1 transposon indsætte i nogen ikke-essentielt gen i genomet af P. aeruginosa. Dette giver ca 18 TA indsættelse steder pr åbne læseramme i PAO1 genom.

Her beskriver vi en protokol ved hjælp af mini-himar1 transposon-medieret mutagenese at identificere nye regulatorer af mucoidy i P. aeruginosa. Mere specifikt, vi biparentally konjugeret den pFAC vektor indeholdende et mini-himar1 transposon fra E. coli SM10/λpir i nonmucoid prototrof stamme PAO1. Efter transposonet er integreret i genomet, modtagerstammen dyrkes Pseudomonas isolation agar (PIA), som indeholder triclosan, der inhiberer væksten af E. coli. Således er et bibliotek af mutanter af <em> P. aeruginosa kan vælges af væksten på PIA plade suppleret med gentamycin og tilstedeværelsen af mucoid fænotype. Bemærk, at en sand transposon-medieret vs integration mutanten vil have en gentamycin resistente og carbenicillin-følsomme fænotype. I denne undersøgelse blev ca 80.000 insertionsmutanter af PAO1 isoleret gennem fire separate bøjninger. Vi derefter screenet for slimet isolater, og bestemmes insertionsstedet ved restriktionsenzymfordøjelse, ligatur og invers PCR. Vi udførte Southern blot-analyse under anvendelse af gentamicin modstand kassetten som en probe for at se antallet af indsættelse pr genom. Vi fastslået, at mere end 90% af mutanter opnået pr konjugation ved hjælp af denne protokol havde kun en enkelt kopi af himar1 i genomet og vises den gentamycin resistente og carbenicillin-følsomme fænotype. Blev identificeret i alt 32 mucoide isolater, 22 af dem blev kortlagt til forskellige loci af P. aeruginosa PAO1kromosom. Denne sats for indsættelse giver tilstrækkelig dækning for at identificere en række nye regulatorer af alginat overproduktion.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Bakteriestammer biparental Conjugation Podes E. coli SM10/λpir/pFAC i 5 ml Luria Broth (LB) suppleret med 15 ug / ml gentamycin og sted i en ryste-inkubator natten over ved 37 ° C. Podes P. aeruginosa stamme PAO1 i 5 ml LB, og sted i en rysteinkubator natten over ved 42 ° C. Måle OD600 af overnattende kulturer og bland lige store mængder af PAO1 og E. coli pFAC, således at det endelige volumen er mellem 1 til 1,4 ml. …

Representative Results

Som illustreret i figur 1, mini-himar1 mariner transposon vektor pFAC indeholder to 27 bp omvendte gentagelser med TA indsættelsessteder flankerer aacC1 gentamycin modstand kassette med sin σ 70-promotor og et multipelt kloningssted (MCS). Derudover pFAC vektoren indeholder gener, der koder den meget aktive himar1 transposasen, β-lactamase (bla) og tra overførsel operonen. TA indsættelsessteder mulighed for en effektiv integration i genomet af…

Discussion

Det er vigtigt at bemærke, at denne metode kan bruges i andre Pseudomonas arter med disse ændringer: inkuberes P. fluorescens og P. putida ved 30 ° C, og P. stutzeri ved 42 ° C P. stuzeri bør dyrkes på LB-plader suppleret med 150 ug / ml gentamycin og på trin 1.11, P. stutzeri celler skal overføres i 500 ul LB i stedet for 1 ml. Derudover er der to kritiske trin til denne protokol. For det første bør modtagerstammen dyrkes ved den passende temperatur. For e…

Materials

Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 mL Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific