Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts
Summary
We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.
Abstract
Testen het lot van embryonale of pluripotente stamcel-derivaten in vitro protocollen tot controversiële resultaten die niet noodzakelijkerwijs hun in vivo potentie weerspiegelen. Bij voorkeur moet deze cellen in een geschikte embryonale omgeving geplaatst teneinde de definitieve fenotype te verkrijgen. Bovendien heeft cell lineage tracing studies in de muis na het labelen van cellen met kleurstoffen of retrovirale vectoren meestal beperkt tot vroeg stadium muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen gebleven. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we standaard en ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocollen aan verschillende agenten te injecteren in gerichte gebieden van het hart in muizenembryo's op E9.5 en latere stadia van ontwikkeling. Embryonale explant of embryo's worden vervolgens gekweekt of links om verder te ontwikkelen in de baarmoeder. Deze middelen omvatten fluorescerende kleurstoffen, virus, shRNAs of stamcel-afgeleide stamcellen. Onze aanpak kan voor het behoud van de functies van het orgel terwijl het toezicht op de migratie en het lot van gelabelde en / of geïnjecteerde cellen. Deze technologieën kunnen worden uitgebreid naar andere organen en zal zeer nuttig zijn om de belangrijkste biologische vragen te beantwoorden in de biologie van ontwikkeling.
Introduction
Meer dan een decennium geleden, hebben menselijke embryonale stamcellen (HuESCs) is afgeleid van menselijk blastocysts 1. Sindsdien hebben deze cellen het onderwerp van een belangrijk gebied van onderzoek dat onvervulde vragen in ontwikkelingsbiologie mens behandelt te worden. HuESCs zijn verder voorzien van hoop in de regeneratieve geneeskunde. De laatste jaren zijn menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gegenereerd van patiënt-specifieke somatische cellen, die modellen van genetische ziekte 2. Vele in vitro protocollen voor differentiatie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen naar verschillende cellijnen, waaronder hart-lijnen 3, zijn gemeld. De gedifferentieerde cellen worden vaak fenotype door analyse van RNA en eiwit expressie, immunokleuring en / of in vitro functionele testen. Echter, pluripotente stamcellen derivaten in een embryonale juiste omgeving worden geplaatst om te testen of ze de cel volledig verwervenl lot van hun embryonale tegenhanger en of ze recapituleren de echte in vivo functie in reactie op de regionale cues. Terwijl de tissue engineering is veelbelovend, maar nog niet voorzien van alle bekende en onbekende signalen van de echte in vivo ontwikkeling van embryonaal weefsel 4,5.
Cel labeling met kleurstoffen of retrovirale vectoren in embryo, waaronder muizenembryo's hebben belangrijke informatie gebracht over de embryonale oorsprong van cellijnen gedurende cardiale ontwikkeling 6. Bijvoorbeeld, kleurstof injectie in de pericardiale ruimte van muizenembryo's ex vivo, gevolgd door in vitro kweek van geïsoleerde harten, gebruikt om epicardiale cellen en hun nakomelingen 7 etiketteren. Echter, kleurstof en retrovirale cel etikettering zijn meestal toegepast op vroege muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen, of kip embryo's, die beter bereikbaar 8 zijn. Een uitzondering is de hersenen, die gemakkelijker te richten in embryos 9,10. Een dergelijke aanpak is nog niet toegepast op het kloppend embryonale muis hart.
Om direct merken vullen met kleurstoffen of virus en lineage tracing in verder gevorderd stadium muizenembryo's en volwassen muizen uit te voeren, heeft de cel etikettering aanpak gecombineerd met de analyse van transgene muizen met behulp van het Cre / Lox technologie. De Cre / Lox benadering 11 heeft echter een aantal beperkingen in verband met de spatiotemporal specificiteit van de genomische regulatoire gebieden die de expressie van het recombinase drijven, en de efficiëntie van het Cre / Lox recombinatie 12. Bovendien is deze aanpak niet volledig in op de specifieke vragen van de cel-migratie gedreven overname van cel lot als het slechts een voorloper kan labelen na activering van de regulerende gebied gebruikt om Cre expressie rijden. Het kan ook niet van toepassing op menselijke embryo's voor de hand liggende ethische kwesties.
Gezien deze beperkingen we een reeks nieuwe p ontworpenrotocols van verschillende cel merkmiddelen, zoals fluorescerende kleurstoffen, virus, genexpressie modulatoren zoals shRNAs en DNA-gebaseerde mobiele etikettering vectoren of cellen in het muizenembryo op E9.5 en latere ontwikkelingsstadia injecteren in gerichte gebieden van de hart.
Het DNA / cel injecties een stereomicroscoop en een eenvoudige micro-injectie toestel gecombineerd met ex vivo embryo cultuur tot 48 uur, of geïsoleerde hart of embryonale explantaatkweek voor 48-72 uur. We een ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocol in muis embryonale harten in de baarmoeder ook verslag. Deze techniek maakt het toezicht op de ontwikkeling van embryo's 13 en zorgt voor lange termijn follow-up van de injectates en / of gelabelde cellen.
We vonden dat deze benaderingen behouden de functie van het orgaan en een meer representatieve omgeving dan in vitro testen stamcellen potentieel. Het biedt ook de mogelijkheid om migratie te volgengelabelde en / of geïnjecteerde cellen aan hun lot controleren. Uiteindelijk zou dit een beter begrip van regionale weefsel patronen en belangrijke biologische processen leveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intra-cardiale ex vivo injectie protocollen hierboven beschreven zijn ontworpen om hartfunctie gedurende minstens 48 uur in mid-stage (E9.5-E11.5) muizenembryo's te behouden. Deze injectie aanpak kan voor ruimtelijk gerichte injectie van DNA of cellen. De weinige voorbeelden in figuren 1-3 bieden proof of concept voor de afbakening ex vivo en in vivo moleculaire mechanismen van ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden in beperkte cardiale regio's, zoals EMT van endoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de Foundation Leducq (mitralisklep) en het Agence Nationale pour la Recherche (ANR verlenen Specistem) voor de financiering van dit onderzoek.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
