भ्रूण माउस दिल के विकास में सेल लेबलिंग और इंजेक्शन
Summary
हम (ई) 9.5 और बाद के चरणों भ्रूण दिन पर माउस भ्रूण भीतर भ्रूण या pluripotent कोशिकाओं से व्युत्पन्न अंतर्जात और grafted कोशिकाओं के सेल भाग्य और phenotype दोनों पर नजर रखने के क्रम में, रंग इंजेक्षन करने के लिए डीएनए वैक्टर, वायरस, और कोशिकाओं के तरीकों की एक श्रृंखला का वर्णन विकास की.
Abstract
इन विट्रो प्रोटोकॉल में भ्रूण या pluripotent स्टेम सेल डेरिवेटिव के भाग्य का परीक्षण जरूरी उनके vivo क्षमता को प्रतिबिंबित नहीं करते कि विवादास्पद परिणामों के लिए प्रेरित किया. अधिमानतः, इन कोशिकाओं को अपनी निश्चित phenotype के अधिग्रहण के क्रम में एक उचित भ्रूण वातावरण में रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, रंग या रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के बाद माउस में पढ़ाई अनुरेखण सेल वंश अभी भी खराब विकसित अंगों के साथ प्रारंभिक चरण माउस भ्रूण ज्यादातर सीमित रह गया है. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम E9.5 और विकास के बाद के चरणों में माउस भ्रूण में हृदय की लक्षित क्षेत्रों में विभिन्न एजेंटों इंजेक्षन मानक और अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता microinjection प्रोटोकॉल बनाया गया. भ्रूण explant या भ्रूण तो सुसंस्कृत या आगे गर्भ में विकसित करने के लिए रह गए हैं. इन एजेंटों फ्लोरोसेंट रंजक, वायरस, shRNAs, या सेल व्युत्पन्न पूर्वज स्टेम सेल शामिल हैं. हमारे दृष्टिकोण फू के संरक्षण के लिए अनुमतिअंग की nction प्रवास और लेबल और / या इंजेक्शन कोशिकाओं के भाग्य की निगरानी करते हुए. इन प्रौद्योगिकियों अन्य अंगों के लिए बढ़ाया जा सकता है और विकास के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण जैविक सवालों का पता करने के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा.
Introduction
एक दशक से अधिक पहले, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (HuESCs) मानव ब्लास्टोसिस्ट्स 1 से प्राप्त किया गया है. तब से इन कोशिकाओं को मानव विकास जीव विज्ञान में unmet सवालों के पते जो अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र का विषय बन गए हैं. HuESCs इसके अलावा पुनर्योजी चिकित्सा में आशाओं की व्यवस्था की है. हाल के वर्षों में, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) आनुवंशिक रोग 2 के मॉडल उपलब्ध कराने, रोगी विशेष दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया है. दिल प्रजातियों 3 सहित विभिन्न सेल प्रजातियों, की ओर से भ्रूण या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में कई, सूचित किया गया है. विभेदित कोशिकाओं अक्सर आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति, immunostaining, और / या इन विट्रो कार्यात्मक परीक्षण में के विश्लेषण से phenotyped कर रहे हैं. हालांकि, pluripotent स्टेम सेल डेरिवेटिव वे पूरी तरह से सीईएल अधिग्रहण परीक्षण है कि क्या क्रम में एक उचित भ्रूण वातावरण में रखा जाना हैएल उनके भ्रूण समकक्ष के भाग्य और वे क्षेत्रीय संकेत के जवाब में वास्तविक vivo समारोह पुनरावृत्ति या नहीं. ऊतक इंजीनियरिंग होनहार है, यह अभी तक भ्रूण ऊतक 4,5 विकासशील विवो में उचित के सभी ज्ञात और अज्ञात cues प्रदान नहीं करता है.
माउस भ्रूण सहित भ्रूण में रंगों या रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ सेल लेबलिंग, हृदय विकास 6 के दौरान सेल प्रजातियों के भ्रूण मूल के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी लाया है. उदाहरण के लिए, अलग दिलों की इन विट्रो संस्कृति द्वारा पीछा पूर्व vivo माउस भ्रूण की पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में इंजेक्शन डाई, epicardial कोशिकाओं और उनके वंश 7 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, डाई और रेट्रोवायरल सेल लेबलिंग ज्यादातर 8 अधिक आसानी से उपलब्ध हैं, जो अभी भी खराब विकसित अंगों, या चिकन भ्रूण, साथ जल्दी माउस भ्रूण को लागू किया गया है. एक अपवाद ई में लक्षित करने के लिए आसान है, जो मस्तिष्क है,mbryos 9,10. इस तरह के एक दृष्टिकोण अभी तक पिटाई भ्रूण माउस दिल के लिए लागू नहीं किया गया है.
रंगों या वायरस के साथ सीधे लेबलिंग के पूरक हैं और अधिक उन्नत चरण माउस भ्रूण और वयस्क चूहों में अनुरेखण वंश प्रदर्शन करने के लिए, सेल लेबलिंग दृष्टिकोण Cre / Lox प्रौद्योगिकी का उपयोग कर ट्रांसजेनिक चूहों के विश्लेषण के साथ संयुक्त कर दिया गया है. Cre / Lox दृष्टिकोण 11 तथापि recombinase की अभिव्यक्ति ड्राइव किया जीनोमिक विनियामक क्षेत्रों के spatiotemporal विशिष्टता, और रचनात्मक / Lox पुनर्संयोजन 12 की दक्षता की वजह से कुछ सीमाएं सुविधाएँ. यह केवल Cre अभिव्यक्ति ड्राइव किया विनियामक क्षेत्र की सक्रियता के बाद एक अग्रदूत लेबल कर सकते हैं इसके अलावा, इस दृष्टिकोण पूरी तरह से सेल भाग्य की सेल प्रवास संचालित अधिग्रहण की विशिष्ट सवालों का पता नहीं है. यह भी स्पष्ट नैतिक मुद्दों के लिए मानव भ्रूण को लागू नहीं कर सकते.
इन सीमाओं को देखते हुए, हम पी की एक श्रृंखला तैयारके लक्षित क्षेत्रों में जैसे फ्लोरोसेंट रंजक, वायरस, ऐसे shRNAs और डीएनए आधारित सेल लेबलिंग वैक्टर के रूप में जीन अभिव्यक्ति modulators, या E9.5 और विकास के बाद के चरणों में माउस भ्रूण में कोशिकाओं के रूप में सेल लेबलिंग एजेंटों की एक किस्म इंजेक्षन rotocols दिल.
डीएनए / सेल इंजेक्शन एक stereomicroscope और 48 घंटा, या 48-72 घंटे के लिए पृथक दिल या भ्रूण explant संस्कृति अप करने के लिए पूर्व vivo भ्रूण संस्कृति के साथ संयुक्त एक सरल microinjection डिवाइस का उपयोग करें. हम भी गर्भ में भ्रूण माउस दिलों में एक अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता microinjection प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. इस तकनीक भ्रूण 13 के विकास की निगरानी की अनुमति देता है और injectates और / या लेबल कोशिकाओं की लंबी अवधि अनुवर्ती के लिए अनुमति देता है.
हम इन तरीकों अंग के समारोह के संरक्षण और स्टेम सेल की क्षमता के इन विट्रो में परीक्षण की तुलना में एक अधिक प्रतिनिधि वातावरण प्रदान करते पाया. यह भी माइग्रेशन का पालन करने का अवसर प्रदान करता हैके अपने भाग्य पर नजर रखने के लिए कोशिकाओं लेबल और / या इंजेक्शन. अंत में, यह क्षेत्रीय ऊतक patterning और महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ उपज चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर वर्णित अंतर हृदय पूर्व vivo इंजेक्शन प्रोटोकॉल मध्य मंच (E9.5-E11.5) माउस भ्रूण में कम से कम 48 घंटे के लिए दौरे समारोह संरक्षित करने के लिए तैयार कर रहे हैं. ये इंजेक्शन दृष्टिकोण डीएनए या कोशिकाओं के स्था…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों फाउंडेशन Leducq (mitral) और एजेंस नेशनल इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए ला Recherche (ANR Specistem अनुदान) डालना स्वीकार करते हैं.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
