Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Published: May 27, 2014 doi: 10.3791/51358
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University

Summary

وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. استخدام العادي على مراحل اللوني السائل إلى جانب عالية الدقة قياس الطيف الكتلي مع تبديل قطبية ودورة العمل السريع، ونحن تصف البروتوكول لتحليل تكوين الأيض القطبية من المواد البيولوجية مع حساسية عالية، ودقة، والقرار.

Abstract

وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. ومع ذلك، والمنصات الحالية لديها العوامل التي تحد مختلفة، مثل عمالة كثيفة عينة الاستعدادات، وحدود الكشف منخفضة، وسرعات المسح الضوئي بطيئة أو أسلوب الأمثل مكثفة لكل الأيض، وعدم القدرة على قياس إيجابا وسلبا الأيونات المشحونة في التجارب احدة. وبالتالي، يمكن لبروتوكول الايض الرواية تقدم دراسات الايض. اللوني ماء مقرها أميد-تمكن من تحليل المستقلب القطبية دون أي اشتقاق الكيميائية. عالية الدقة باستخدام MS Q-Exactive (QE-MS) قد تحسنت البصريات أيون، زيادة سرعات المسح الضوئي (256 ميللي ثانية في قرار 70،000)، ولديه القدرة على تنفيذ الإيجابية / السلبية التبديل. يستخدم إستراتيجية استخراج الميثانول الباردة، واقتران عمود أميد مع QE-MS تمكن الكشف قوية من 168 الأيض وآلاف القطبية المستهدفة من الميزات الإضافية في وقت واحد. داتويتم تجهيز خارجا مع البرمجيات المتاحة تجاريا بطريقة ذات كفاءة عالية، وميزات غير معروف المستخرجة من أطياف الشامل يمكن الاستعلام في قواعد البيانات.

Introduction

الايض، الذي يعرف بأنه تجربة يقيس نواتج متعددة في وقت واحد كان، وهي منطقة شديدة الأهمية. يوفر الايض قراءات مباشرة لعلم وظائف الأعضاء الجزيئية وقدمت رؤى في التنمية وأمراض مثل السرطان 1-4. الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والغاز اللوني الطيف الكتلي (GC-MS) هي من بين الأكثر شيوعا الصكوك 5-9. NMR، وخاصة استخدمت لتدفق التجارب منذ النظائر الثقيلة المركبات المسمى، مثل C 13 الأيض المسمى، هي NMR-النشطة 10،11. ومع ذلك، يتطلب هذه الاستراتيجية عالية نسبيا نقاء عينة وكمية كبيرة العينة، الأمر الذي يحد من تطبيقاتها في الايض. وفي الوقت نفسه، البيانات التي تم جمعها من NMR تحليل الاحتياجات مكثفة وتخصيص مجمع معقدة NMR أطياف أمر صعب. وقد GC-MS تستخدم على نطاق واسع لنواتج الأيض القطبية والدراسات الدهون، لكنه يتطلب compoun متقلبةس، وبالتالي غالبا ما اشتقاق من نواتج الأيض، الذي ينطوي في بعض الأحيان الكيمياء المعقدة التي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ويدخل الضوضاء التجريبية.

اللوني السائل (LC) بالإضافة إلى الثلاثي مطياف الكتلة رباعي يستخدم رباعي الأولى لاختيار الأيونات الأم سليمة، والتي يتم بعد ذلك مجزأة في رباعية الثانية، في حين يتم استخدام رباعي الثالث لتحديد شظايا مميزة أو الأيونات ابنة. هذا الأسلوب، الذي يسجل الانتقال من الأم إلى أيونات أيونات ابنة محددة، ويطلق متعددة رصد رد فعل (MRM). MRM هو طريقة حساسة جدا ومحددة، وقوية لكل من جزيء صغير من البروتين والكميات 12-15،21. ومع ذلك، MRM لديها حدودها. لتحقيق نوعية عالية يحتاج إلى أسلوب MRM سيتم بناؤها لكل المستقلب. يتكون هذا الأسلوب من تحديد جزء معين وما يقابلها من الطاقة الاصطدام الأمثل، الأمر الذي يتطلب قبل معرفة PROPErties من نواتج الأيض من الفائدة، مثل معلومات التركيب الكيميائي. لذلك، مع بعض الاستثناءات التي تنطوي على خسارة محايدة من شظايا مشتركة، فإنه ليس من الممكن تحديد مستقلبات غير معروفة مع هذا الأسلوب.

في السنوات الأخيرة، وقد تم إطلاق سراح عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (HRMS) والصكوك، مثل سلسلة LTQ-orbitrap وExactive، وQuanTof، وTripleTOF 5600 16-18،22. يمكن نظام إدارة الموارد البشرية توفير الشامل لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من الأيونات سليمة داخل خطأ من عدد قليل من جزء في المليون. وبالتالي، أداة نظام إدارة الموارد البشرية تعمل عن طريق الكشف عن أيونات السلائف (أي وضع المسح الضوئي الكامل) يمكن الحصول على معلومات مباشرة من الهيكلية الشامل الدقيق والتركيب العنصري مما أدى لتحليلها، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد نواتج المحتملة. في الواقع، كل المعلومات عن مركب يمكن الحصول عليها مع الشامل الدقيق، وتصل إلى مستوى أيزومرات الهيكلي. أيضا، كاملطريقة مسح لا تتطلب معرفة سابقة من نواتج الأيض و لا يتطلب الأسلوب الأمثل. علاوة على ذلك، لأن جميع الأيونات مع م / ض الوقوع في تفحص نطاق يمكن تحليلها، نظام إدارة الموارد البشرية لديها قدرة غير محدودة تقريبا من حيث عدد الأيض التي يمكن قياسها كميا في شوط واحد مقارنة مع الطريقة MRM. نظام إدارة الموارد البشرية هي أيضا قابلة للمقارنة إلى MRM رباعي الثلاثي في ​​القدرات الكمي نظرا لدورة عمل قصيرة مما أدى إلى عدد مماثل من نقاط البيانات التي يمكن الحصول عليها في MS مسح كامل. وبالتالي، يوفر نظام إدارة الموارد البشرية نهجا بديلا لالايض الكمي. في الآونة الأخيرة، ووصف نسخة محسنة من نظام إدارة الموارد البشرية Q-Exactive مطياف الكتلة (QE-MS) يمكن تشغيلها تحت التبديل بين الأوضاع الإيجابية والسلبية مع دورة مرات سريع بما فيه الكفاية في أسلوب واحد، والذي يوسع نطاق الكشف عن 19. نحن هنا تصف استراتيجية الايض لدينا باستخدام QE-MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد LC-MS الكواشف، إنشاء طرق اللوني، وإنشاء صك إجراءات التشغيل

  1. إعداد المذيبات LC
    1. إعداد 500 مل مراحل المحمول. (أ) هو خلات الأمونيوم 20 ملي و 15 ملي هيدروكسيد الأمونيوم في 3٪ الأسيتونيتريل / المياه، ودرجة الحموضة 9.0 النهائي؛ وB هو 100٪ أسيتونتريل.
    2. فضفاضة لحد الزجاجة، وضعه في sonicator حمام الماء، ويصوتن لمدة 10 دقيقة دون تدفئة إضافية. (هذه الخطوة هو التأكد من أن كل من أملاح الأمونيوم تذوب تماما وأنه لا توجد فقاعات الهواء المتبقية.)
    3. نقل 250 مل من المذيب لزجاجة 250 مل زجاج للاستخدام LC-MS، والحفاظ على ما تبقى في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الحل معايرة انخفاض نطاق شامل. من المهم استخدام مجموعة مخصصة انخفاض كتلة خليط المعايرة للتطبيقات الايض لضمان الكشف عن أن الجماهير دقيقة في أوزان جزيئية منخفضة.
    1. تزن 5 ملغ من كلا سودىأم فلوروآسيتات وحمض homovanillic وحل لهم في 5 مل من الماء لجعل تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. حل ديازينون في الميثانول لجعل تركيز النهائي من 10 ملغ / مل.
    2. لإعداد 1 مل من محلول المعايرة السلبية منخفضة الشامل، وخلط 960 مل من محلول المعايرة الحرارية السلبية مع 20 مل من fluoroaceate الصوديوم ومحلول حمض homovanillic. لجعل 1 مل من محلول المعايرة إيجابية منخفضة الشامل، وخلط 990 مل من محلول المعايرة الحرارية إيجابية و 10 مل من محلول الديازينون. (يجب أن يتم تخزين الحل معايرة انخفاض كتلة في 4 درجات مئوية، ويكون مستعدا جديدة كل 2 أشهر.)
  3. معايرة QE-MS في نطاق كتلة منخفضة
    1. قبل تنفيذ منخفض مجموعة كتلة المعايرة، وإجراء معايرة الكتلة القياسية (م / ض، 150-2،000) في أوضاع كل من الإيجابية والسلبية بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
    2. مرة واحدة يمر معايرة الكتلة العادية، وضبط لمسح مجموعة 60-900 م / ض في لوحة التحكم الصكويتم تطبيق CID مصدر 25 فولت لوضع إيجابي و 35 إلكترون فولت لوضع سلبي. (وهذا يعطي إشارات قوية من الكافيين جزء ايون وايون الكبريتات. تم إصلاح مسح مجموعة هنا، وذلك لأن مشاركة م / ض لا ينبغي أن يكون أكبر من 15X بدءا من م / ض)
    3. مرة واحدة المصدر أيون مستقرة، ثم إجراء معايرة حسب الطلب. ملاحظة: يتم تعريف مصدر مستقر وأقل من 10٪ من إجمالي التباين أيون الحالية في وضع إيجابي، وأقل من 15٪ في وضع سلبي. يتم سرد أيونات المعايرة حسب الطلب والمقابلة م / ض في الجدول 1.
  4. إنشاء الأجهزة LC-MS لتحليل المستقلب القطبية. ويقترن LC إلى QE-MS لفصل الأيض والكشف.
    1. تجهيز QE-MS مع بتدفئة التحقيق التأين electrospray (H-ESI). تعيين المعلمات ذات الصلة لضبط التحقيق على النحو المبين: درجة حرارة سخان، و 120 درجة مئوية؛ الغاز غمد، 30؛ الغاز المساعدة، 10؛ اكتساح الغاز، 3؛ رذاذ الجهد، 3.6 كيلو فولت لوضع إيجابية و 2.5 كيلو فولت لوضع سلبي. ضبط درجة الحرارة الشعرية في 320 درجة مئوية، وS-العدسة في 55.
    2. بناء طريقة مسح كامل على النحو التالي: كامل تفحص نطاق: 60-900 (م / ض)؛ القرار: 70،000؛ الحد الأقصى للوقت حقن: 200 ميللي ثانية مع أوقات نموذجية حقن حوالي 50 مللي ثانية؛ التحكم الآلي مكسب (AGC): 3،000،000 الأيونات. هذه الإعدادات تؤدي إلى دورة العمل من حوالي 550 ميللي ثانية لتنفيذ عمليات التفحص في وضع حد سواء الإيجابية والسلبية.
    3. إنشاء الأسلوب اللوني. توظيف عمود أميد (100 × 2.1 مم الهوية، 3.5 ملم) لفصل المركب في درجة حرارة الغرفة 13،15. الطور المتحرك (أ) هو كما هو موضح أعلاه، والطور المتحرك B هو أسيتونتريل. استخدام الانحدار الخطي كما يلي: 0 دقيقة، 85٪ B؛ 1.5 دقيقة، 85٪ B، 5.5 دقيقة، 35٪ B؛ 10min، 35٪ B، 10.5 دقيقة، 35٪ B، 14.5 دقيقة، 35٪ B، 15 دقيقة، 85٪ B، و 20 دقيقة، و 85٪ B. معدل تدفق 0.15 مل / دقيقة 0-10 دقيقة و 15 إلى 20 دقيقة، و 0.3 مل / دقيقة 10،5-14،5 دقيقة.

2. العلاقات العامةeparation العينات المستقلب

  1. إعداد المذيبات استخراج. خلط 40 مل الميثانول (LC-MS الصف) و 10 مل من الماء (LC-MS الصف) في أنبوب 50 مل، ويبقيه في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. ملاحظة: هذا الإجراء والخطوات التالية يمكن تعديلها لاستخراج عينات الأنسجة البيولوجية والسوائل.
    1. ثقافة القولون HCT السرطان 8 خلايا في ثلاثة أطباق 10 سم أو 6 لوحات جيدة مع متوسط ​​النمو الكامل، 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100،000 وحدة / L البنسلين و 100 ملغم / لتر الستربتوميسين.
    2. عندما تصل خلايا التقاء 80٪، وإزالة بسرعة متوسطة، ووضع طبق أو لوحة على رأس 13،15 الثلج الجاف. إضافة 1 مل الاستخلاص بالمذيبات على الفور (80٪ الميثانول / الماء)، ونقل لوحة إلى -80 ° C الفريزر. لطبق 10 سم، وإضافة 3 مل من الاستخلاص بالمذيبات إلى كل بئر. (في محاولة لإزالة المتوسطة قدر الإمكان لتجنب تأثير قمع أيون بسبب الأملاح المتبقية من المتوسط.)
    3. ترك لوحة لمدة 15 دقيقة. إزالته من الثلاجة، وتتخلص من الخلايا في المذيب على الثلج الجاف. نقل الحل إلى 1.7 مل أنابيب إيبندورف، وأجهزة الطرد المركزي مع سرعة 20،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. (إعداد نواتج الأيض الخلوي من ثلاثة أطباق منفصلة لجعل ثلاث عينات تكرار. الغرض من حفظ أنبوبين هو أن يكون واحدا على سبيل الاحتياط.)
    4. نقل طاف لاثنين من أنابيب إيبندورف جديدة، وتجفيفها في فراغ السرعة. وهذا يستغرق حوالي 3-6 ساعة اعتمادا على الفراغ سرعة استخدامها. (العينات ويمكن أيضا أن تجفف بين عشية وضحاها تحت غاز النيتروجين.)
    5. بعد التجفيف، وتخزين الأنابيب من كل عينة في الفريزر -80 درجة مئوية. عندما تصبح جاهزة، إعادة عينة واحدة في 20 مل من الماء (LC-MS الصف)، وحقن 5 مل لLC-MS-التيسير الكمي للتحليل.

3. إعداد عينة من تسلسل

  1. مرة واحدة وقد تم تنفيذ معايرة بشكل صحيح خارج على QE-MS، تتوازن العمود LC لمدة 5 دقائق مع 85٪ A في تدفقمعدل 0.15 مل / دقيقة، وهو الشرط بدءا من التدرج LC.
  2. إعداد تسلسل العينة في ترتيب عشوائي. ملاحظة: في هذه الطريقة، فإنه يوزع التقلبات التي أدخلتها LC-MS لكل عينة ويضمن المقارنة أكثر دقة بين عينات مختلفة. كل 6 عينات، إضافة إلى غسل المدى، والذي يسير على نفس طريقة MS، باستثناء التدرج LC 95٪ A لمدة 10 دقيقة وتليها عمود موازنة 5 دقائق في 85٪ A مع معدل تدفق 0.15 مل / دقيقة. إضافة عينات فارغة (100٪ ماء) يغسل بعد كل شوط لتقييم خلفية النظام وتحمل أكثر المستويات.
  3. حفظ تسلسل ومرة ​​يظهر العمود LC الضغط مستقر، حوالي 400 رطل، بدء تشغيل التسلسل. إذا لم يكن هناك عينة أخرى يتم ليتم تشغيلها بعد هذا التسلسل، ثم تضاف تشغيل المحطة في نهاية تسلسل، والتي لديها معدل تدفق 0 مل / دقيقة في نهاية التدرج واختر "الاستعداد" بعد الانتهاء من التسلسل.
  4. إعادة تشغيل تعيين نفس العينة 12 ساعة بعد المعايرة. (هذا أناق لتقييم تقلب الخطأ الشامل بعد المعايرة.)

4. مشاركة وتحليل الصك التنظيف والصيانة

  1. في نهاية تسلسل، وغسل العمود مع 95٪ A بمعدل تدفق 0.2 مل / دقيقة لمدة 2 ساعة، وإذا لزم الأمر، عكس العمود قبل الغسيل.
  2. إزالة العمود LC والاتصال مباشرة LC إلى مصدر أيون من قبل الاتحاد. إعداد تنظيف المذيبات والماء / الميثانول / حامض الفورميك (ت: ت: ت، 90:10:0.2)، تعيين MS على وضع الاستعداد، ونظام غسيل LC-MS في معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة لإزالة المتبقي عجلت أملاح أو غيرها من الشوائب. خفض معدل التدفق إذا كان هناك الكثير من الضغوط النظام.
  3. ضبط درجة الحرارة الشعرية عند 50 درجة مئوية، وإزالة القفص أيون. تأخذ بعناية مخروط أيون الاجتياح وأنبوب نقل أيون بعد انخفاض درجة الحرارة الشعرية إلى 50 درجة مئوية. استخدام شبكة الخام، مثل الصنفرة، لإزالة الشوائب المتبقية على سطح مخروط أيون الاجتياح.
  4. وضع نقل أيونأنبوب إلى أنبوب 15 مل الصقر تحتوي على 10 مل 90٪ من المياه / الميثانول مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. بعد sonicating الأنبوب في sonicator حمام الماء لمدة 20 دقيقة، صب المذيب الداخل، استبدالها مع 10 مل الميثانول النقي ويصوتن لمدة 20 دقيقة أخرى. (إذا لزم الأمر، يمكن أن يتم صوتنة عند 40 درجة مئوية أو درجة حرارة أعلى من ذلك لتحقيق نتائج أفضل التنظيف.)

5. تحليل LC-MS البيانات

  1. لضمان تسلسل عينة تدير على نحو سلس، وبعد الانتهاء من العينتين الأولى في التسلسل، والتحقق من قمم لمستقلبات غير معروفة. استخدام ملف CSV سرد أسماء الأيض، والصيغة الكيميائية محايدة طريقة الكشف عن (إما إيجابية أو سلبية)، وملف الإدخال، ويحتوي على ملف الإخراج استخراج القمم والخطأ الشامل في جزء في المليون. إذا كان شكل ذروة غير طبيعي أو الخطأ الشامل هو خارج من قبل أكثر من 5 جزء في المليون، ثم بقية التسلسل يحتاج إلى وقفه واستكشاف الأخطاء وإصلاحها يحتاج إلى القيام به.
  2. اختيار طريقة "محاذاة الذروةوالإطار استخراج "على البرمجيات المتاحة تجاريا. حدد البيانات الخام من LC-MS وتجميعها. اختيار العينات في منتصف تسلسل تشغيل ك عينة مرجعية اللوني للمحاذاة الذروة. تحميل البذور الإطار بما في ذلك التمثيل الغذائي المعروفة لتحليل نواتج المستهدفة مع البيانات التي تم جمعها والمقابلة البذور الإطار.
  3. إجراء تحليل البيانات في وضع الإيجابية والسلبية بشكل منفصل. استخدام الإعداد الافتراضي لغيرها من المعالم. إيقاف وظيفة البحث قاعدة البيانات وتشغيل سير العمل. تصدير البيانات التي تتم معالجتها بوصفها ورقة اكسل تحتوي على منطقة ذروة كل إطار. مجموعات الأولى من إطارات تتوافق مع نواتج الأيض في القائمة المستهدفة. ملاحظة: للاطلاع على تحليل المستقلب المستهدفة، يتم الحصول على المعلومات الأيض استنادا إلى دراسات سابقة 13،15.
  4. لتحليل المستقلب تشتته، واختيار طريقة "استخراج مكون". تحميل عينات فارغة للالطرح الخلفية. تعيين ذروة كثافة عتبةر 10 5، عرض م / ض من 10 جزء في المليون وإشارة إلى نسبة الضوضاء 3.
  5. استخدام قاعدة البيانات metabolome الإنسان لتحديد المركبات غير معروف. استخدام مرشح السيرة الذاتية لإزالة المكونات مع السير الذاتية كبيرة داخل عينات تكرار. تذهب يدويا من خلال كل مكون واختيار تلك مع ذروة محددة جيدا أو فرق كبير نسبيا في أنواع عينات مختلفة للبحث قاعدة البيانات. تصدير البيانات مع يضرب في قاعدة بيانات. (محاذاة الذروة يمكن تجاوزه إذا كانت النتيجة المحاذاة الذروة منخفض جدا.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

دقة البيانات الايض يعتمد بشكل كبير على أداء أداة LC-MS-التيسير الكمي. لتقييم ما إذا كانت أداة تعمل في حالة جيدة، وإذا كانت طريقة تطبيقها هو الصحيح، يتم استخراج عدة قمم LC المستقلب المعروف من مجموع اللوني ايون (TIC)، كما هو مبين في الشكل 1. مستقلبات القطبية، بما في ذلك الأحماض الأمينية، وسيطة تحلل ، وسيطة TCA، النيوكليوتيدات، والفيتامينات، ATP، NADP + وهلم جرا يكون الاحتفاظ جيدة على العمود وذروة جيدة الأشكال في العمود أميد في ظل ظروف LC الحالي. وفي الوقت نفسه، يتم اختبار الخطأ الشامل في غضون 24 ساعة بعد انخفاض المعايرة الشامل، كما هو موضح في الشكل 2. يتم تشغيل 6 تركيزات مختلفة من العينات في ثلاث نسخ مرتين بعد المعايرة، ومجموعة طوال الوقت يغطي ما يقرب من 24 ساعة. ويتم تقييم الخطأ الشامل بمقارنة الكشف عن م / ض إلى النظرية م / ض من المركبات المستهدفة. هنا الأيضات المستهدفة لديها م / ضتتراوح بين 74 (الجلايسين) إلى 744 (NADP +). المحور Y هنا يمثل نسبة التراكمي من المركبات ضمن نطاق الخطأ معينة الشامل. ويبين المنحنى الأزرق النتيجة 0-12 ساعة، في حين يظهر منحنى اللون الأحمر على البيانات التي تم جمعها 12-24 ساعة. الشكل 2 يشير بوضوح إلى أن أكثر من 90٪ من المركبات ضمن 5 الخطأ الشامل جزء في المليون، وهو ما يعني كتلة منخفضة طريقة معايرة مجموعة ضعت هنا يكفي للحفاظ على الخطأ الشامل 5 جزء في المليون لانخفاض الكشف عن مجموعة والشامل.

قضية أخرى لمعالجتها هو حساسية الصك مع الطريقة الحالية والإعداد الصك. وقد تم التخفيف من المسلسل عينات من ثلاث نسخ طبق بتري 10 سم 5 مرات مع عامل التخفيف من 6، وتنتهي مع 6 تركيزات مختلفة من العينات. هذه العينات تمثل كمية من المركبات المستخرجة من 10 7، 1.67 × 10 6، 2.78 × 10 5، 4.63 × 10 4، 7.72 × 10 3، و1.29× 10 3 من الخلايا، على التوالي. منذ يتم إعداد كل تركيز العينة في ثلاث نسخ، ويتم تحليل ما مجموعه 18 عينة في LC-MS-التيسير الكمي. يتم استخدام قائمة هادفة لتقييم عدد من المركبات في الكشف عن اختلاف تركيز العينة. النتيجة في الشكل 3 يشير إلى أن العدد الأمثل من نواتج الأيض استهدفت الكشف عن ما بين 2.78 × 10 5 و 1.67 × 10 6 خلايا، في حين تعطي 1 × 10 7 خلايا عددا أقل من المركبات المكتشفة، التي من المقرر أن أيون آثار القمع. هذه النتيجة تشير إلى أن المبلغ الأمثل للخلايا لاستخراج لهذا التحليل هو ما يقرب من ذلك من بئر في لوحة 6 جيدا.

لتحليل المستقلب تشتته، وتستخدم لقطع CV من 20٪ ومتوسط ​​قيمة كثافة من 10 7 إلى تحديد جدول المكونات. وتستخدم هذه السيرة الذاتية ومتوسط ​​كثافة القيم الحدية الصارمة لهذا الهدف المظاهرة. لتحسين استنساخ، ويمكن أن تكون السيرة الذاتية القيم قطعزيادة (على سبيل المثال، 30٪)، في حين تحتاج متوسط ​​قيم الكثافة لتكون انخفضت (على سبيل المثال، 10 5) لتشمل المزيد من القمم. بعد التحقق يدويا قمم، ويتم اختيار المكونات مع الأشكال الجيدة والبحث عنها في قاعدة البيانات metabolome الإنسان. وتظهر النتائج في الجدول 2. يسرد الجدول 2A النتائج من البيانات التي تم جمعها في وضع إيجابي، في حين يبين الجدول 2B النتائج من وضع سلبي. بعض نواتج الأيض المحددة هنا تتداخل مع الأيض في القائمة المستهدفة، مثل الجلوتاثيون، البرولين، وهلم جرا، ولكن وفي الوقت نفسه، يتم استكشاف نواتج إضافية غائبة من القائمة المستهدفة، مثل methyglyoxal، والتي يمكن أن تستمد من تحلل، و1 -بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine، التي تم الكشف عنها في وقت إيجابية مع الاحتفاظ 3.2 دقيقة، وهو الاحتفاظ معقولة لالفوسفورية على عمود أميد. وكان من البروتوكول على تشتته البحث قاعدة بيانات المستقلب العلاقات العامةذكرت eviously 20.

الشكل 1
الشكل 1. أمثلة LC-MS قمم اللوني، وهنا، يتم إنشاء اللوني أعيد بناؤها مع نافذة كتلة من 10 جزء في المليون (م / ض ± 5 جزء في المليون). يظهر محور X الوقت الاحتفاظ، في حين يظهر محور Y كثافة النسبية، ويتم سرد شدة ذروة فوق كل المستقلب. يظهر القمم الكشف عن من وضع إيجابي، في حين يبين B قمم من وضع سلبي. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. 60؛ تقييم منخفض النطاق الشامل معايرة المحور Y هو النسبة المئوية التراكمية من نواتج الأيض مع الخطأ الكشف الشامل داخل 5 جزء في المليون. المحور X هو مدى الخطأ الشامل في جزء في المليون. منحنيات الأزرق والأحمر وتمثل 0-12 ساعة و12-24 ساعة، على التوالي. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
تمثل عدد من مستقلبات استهدفت الكشف عن عدد من كليات التقنية العليا مقابل 8 خلايا الساحات الأحمر الأيض الكشف في وضع إيجابي، الدوائر الزرقاء يعني الأيض قياسها في وضع سلبي، ومثلثات سوداء هي الأعداد الإجمالية للنواتج الأيض من كلا - الرقم 3 تقييم كمية العينة. وضع الإيجابية والسلبية. يظهر محور X عدد HCT 8 خلايا.upload/51358/51358fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

<الدفتيريا> NA
المعايير M / Z، ووضع إيجابية M / Z، وضع سلبي صيغة محايدة محايد الشامل
ن Butylamine 74.096425 NA C 4 H 11 N 73.089149
الكافيين جزء 138.066188 NA C 6 H 8 N 3 O 137.058912
كافيين 195.087652 NA C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
ديازينون 305.108329 NA C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
MRFA الببتيد 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523.25769
فلوروآسيتات N / A 77.004432 C 2 H 3 FO 2 78.011708
كبريتات N / A 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
حمض Homovanillic N / A 181.050634 C 9 H 10 O 4 182.05791
كبريتات دوديسيل N / A 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
توروكولات N / A 514.2844 C 26 H 45 NO 7 S 515.291676

الجدول 1. أدنى معايير معايرة مجموعة الشامل وعلى وجه الدقة م / ض.

<الدفتيريا> 131.05901
CSID اسم صيغة نظير أحادي الكتلة بحث القداس خطأ (جزء في المليون) RT (دقيقة)
234 بيتا ألانين C 3 H 7 NO 2 89.04800 89.04805 0.62 8.08
1057 ساركوزين C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
5735 ألانين C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
568 الكرياتينين C 4 H 7 N 3 O 113.05900 113.05889 1.00 4.41
128566 البرولين C 5 H 9 NO 2 115.06333 115.06338 0.41 7.54
6050 L-(+)-فالين C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
7762 الأميل النتريت أنا C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
135 5 الأحماض الأمينية بنتانويك C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
242 trimethylglycine C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
911 نياكيناميدي C6H6N2O 122.04800 122.04793 0.55 2.60
1091 Taurin C 2 H 7 NO 3 S 125.01466 125.01469 0.20 7.61
1030 حمض hydroxycarboxylic بيرولين C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
7127 PCA C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
90657 N-Acryloylglycine C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
388752 5 أوكسو-D-البرولين C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
389257 3 هيدروكسي حمض 3 ،4-ثنائي هيدرو-2H-بيرول-5-الكربوكسيلية C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
8031176 حمض Pyrrolidonecarboxylic C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.03 8.51
5605 الهيدروكسي C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131.05824 5.83 8.08
79449 ميلان علاء-OH C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
167744 L-الجلوتاميك غاما-ألدهيد نصفي C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
388519 5 الأمينية-2-oxopentanoic حمض C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
134 أمينوليفولنيك أسيد C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05901 </ الدفتيريا> 7.70 8.08
9312313 3 هيدروكسي-L-البرولين C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05901 7.70 8.08
566 الكرياتين C 4 H 9 N 3 O 2 131.06900 131.06905 0.36 8.08
5880 L-(+) لوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
6067 L-(+)-آيسولوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
19964 L-نورلوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96 </ الدفتيريا>
388796 بيتا لوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
548 حمض الأمينوكابرويك C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09455 3.48 6.96
6031 L-(-) الهليونين C 4 H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05348 0.10 8.31
109 حمض Ureidopropionic C 4 H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05348 3.71 8.31
6026 L-الأورنيثين C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
64236 D-الأورنيثين C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
5746 الجلوتامين C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
128633 D-الجلوتامين C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
141172 حمض Ureidoisobutyric C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
21436 N-ميثيل <scp> D </ اللجنة الدائمة> حمض الأسبارتيك- C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
21814 D-(-) حمض الجلوتاميك C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
30572 حمض L-(+)-الجلوتاميك C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
58744 N-أسيتيل-L-سيرين C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
5907 L-(-) ميثيونين C 5 H 11 NO 2 S 149.05106 149.05095 0.70 7.39
6038 الحامض الاميني C 6 H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06940 0.48 8.33
5910 L-(-)-فينيلالاناين C 9 H 11 NO 2 165.07898 165.07887 0.63 6.60
1025 البيريدوكسين C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
4463 أكسيدوبامين [USAN: INN] C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
102750 5 - (2-aminoethyl) البايروغالول C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
388394 بافراز C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
6082 L-(+)-أرجينين C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
64224 D-الارجنتين C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
780 أوكسين مغاير C 10 H 9 NO 2 175.06300 175.06304 0.18 2.32
67261 الأندول-3-الأسيتالديهيد، 5 هيدروكسي C 10 H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
3574185 الأندول-2-حمض الأسيتيك C 10 H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
5833 L-(-) التيروسين C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
389285 3 الأمينية-3-(4-hydroxyphenyl) حمض propanoic C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
13628311 L-threo-3-phenylserine C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
425 4 هيدروكسي-4-(3-بيرويل) البوتانويك حمض C 9 H 11 NO 3 181.07401 181.07378 1.25 7.48
13899 3 - (1H-يندول-3-YL) حمض الاكريليك C 11 H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
10607876 حمض Indoleacrylic C 11 H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
389120 N6، N6، N6-ثلاثي مثيل-L-يسين C 9 H 20 N 2 O 2 188.15248 188.15221 1.45 10.87
388321 5 "-S-ميثيل-5" thioadenosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297.08957 297.08898 2.00 2.56
144 9 - (5-S-الميثيل-5-thiopentofuranosyl) 9H-purin-6-الأمينات C 11 H 15 N 5 O 3 S 297.09000 297.08898 3.43 2.56
111188 الجلوتاثيون C 10H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08345 1.14 8.02

الجدول 2A.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID اسم صيغة نظير أحادي الكتلة بحث القداس خطأ (جزء في المليون) RT (دقيقة)
857 Methylglyoxal C 3 H 4 O 2 72.02100 72.02108 1.03 7.70
1057 ساركوزين C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
5735 ألانين C 3 H 7 NO 2 89،04768 89.04747 2.33 8.19
234 بيتا ألانين C 3 H 7 NO 2 89.04800 89.04747 5.93 8.19
55423 حمض اللبنيك-R C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
61460 حمض Hydroxypropionic C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
96860 حمض L-(+)-اللبنيك C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
592 حمض اللبنيك C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
650 ثنائي هيدروكسي أسيتون C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
731 غليسيرألدهيد C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
1086 حمض الكبريتيك H 2 O 4 S 97.96738 97.96683 5.63 8.13
128566 البرولين C 5 H 9 NO 2 115.06333 115.06302 2.67 7.78
1078 حمض السكسينيك C 4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
466979 Erythrono-1 ،4-اكتون C4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
4483398 D-Erythronic ز اكتون C 4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
473 حمض الميثيل C 4 H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
8527138 (3S، 4R) -3،4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H) واحد C 4 H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
140384 حمض 2-ketocaproic C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
164251 حمض Methyloxovaleric C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
388419 (3S)-3-2-ميثيل حمض oxopentanoic C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
46 وأوكسو-ب methylvaleric حمض C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
69 حمض ألفا ketoisocaproic C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
134 أمينوليفولنيك أسيد 131.05800 131.05795 0.36 8.19
9312313 3 هيدروكسي-L-البرولين C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05795 0.36 8.19
5605 الهيدروكسي C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
79449 ميلان علاء-OH C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
167744 L-الجلوتاميك غاما-ألدهيد نصفي C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
388519 5 الأمينية-2-oxopentanoic حمض C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
5880 L-(+) لوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
6067 L-(+)-آيسولوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
19964 L-نورلوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
388796 بيتا لوسين C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
548 حمض الأمينوكابرويك C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09419 6.18 7.09
109 حمض Ureidopropionic C 4 H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05321 1.60 8.28
6031 L-(-) الهليونين C 4 H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05321 2.21 8.28
6026 L-الأورنيثين C 5 H 12 N 2 O 2 132،08987 132.08961 1.98 10.36
64236 D-الأورنيثين C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
193317 L-(-) حمض الماليك C 4 H 6 O 5 134.02153 134.02130 1.72 7.95
510 (±)-حمض الماليك C 4 H 6 O 5 134.02200 134.02130 5.25 7.95
133224 حمض threonic C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
388628 حمض 2،3،4-Trihydroxybutanoic C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
2061231 حمض DL erythronic C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
21436 N-ميثيل <scp> D </ اللجنة الدائمة> حمض الأسبارتيك- C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
21814 D-(-) حمض الجلوتاميك C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
30572 حمض L-(+)-الجلوتاميك C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
58744 N-أسيتيل-L-سيرين C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
6038 الحامض الاميني C 6 H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06930 1.09 8.36
199 آلانتوين C 4 H 6 O 3 N 4 158.04401 158.04387 0.88 4.76
6082 L-(+)-أرجينين C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
64224 D-الارجنتين C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
58576 حمض N-أسيتيل-L-الأسبارتيك C 6 H 9 NO 5 175.04807 175.04803 0.18 7.87
996 حمض Pyrophosphoric H 4 O 7 ف 2 177.94299 177.94331 1.79 8.42
5589 جلوكوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17893 المانوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
58238 . beta.-D-غلوكوبيرانوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
71358 . alpha.-D-غلوكوبيرانوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
134838 3-ديوكسي-arabino hexonic حمض C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388332 L-Sorbopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388476 بيتا-D-غالاكتوبيرانوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388480 . alpha.-D-غالاكتوبيرانوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388775 بيتا-D-فركتوفورانوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
10239179 اينوزيتول C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
16736992 رابطة الدول المستقلة اينوزيتول C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216070 آلوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216093 L-صوربوز C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
201 hexopyranose C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
868 1،2،3،4،5،6-cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
2068 الثيوفيلين C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
4525 1،7 ثنائي ميثيل-الزنثين C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
5236 الثيوبرومين C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
1161 حمض الإيزوسيتريك C 6 H 8 O 7 192.02701 192.02704 0.15 8.18
305 كاريتاس الدوليةحمض TRIC C 6 H 8 O 7 192.02699 192.02704 0.23 8.18
963 حمض البانتوثنيك C 9 H 17 NO 5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
6361 حمض البانتوثنيك-D C 9 H 17 NO 5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
960 حمض البالمتيك C 16 H 32 O 2 256.23999 256.24000 0.05 1.73
111188 الجلوتاثيون C 10 H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08339 1.35 8.03
388337 حمض N-Acetylneuraminic 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392681 N-أسيتيل حمض ألفا neuraminic C 11 H 19 NO 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392810 الحامض اللعابي Neu5Ac C 11 H 19 NO 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43

الجدول 2B.

. الجدول 2 قائمة مستقلبات غير مستهدفة الكشف في كليات التقنية العليا 8 خلايا (2.78 × 10 5 خلايا التكافؤ) 2A و 2B الجدول تشمل مكونات استخراج المعلومات: الوقت الاحتفاظ، م / ض والخطأ الشامل، وفي الوقت نفسه، قاعدة بيانات نتائج البحث: معرف Chemspider ( مركز دراسات) والاسم والصيغة، وهلم جرا. هنا العينات التي تم تحليلها هي المعادلاتلتر إلى مستقلبات المستخرجة من 2.78 × 10 5 خلايا، وعتبة كثافة 1 × 10 7 لتجنب نتيجة شاقة لهدف المظاهرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتنميط المستقلب ناجحة في الخلايا باستخدام هذا البروتوكول هي: 1) السيطرة على النمو المتوسطة واستخراج الدقيق للخلايا؛ 2) تعديل طريقة LC يعتمد على طريقة MS الإعداد لضمان وجود ما يكفي من (عادة لا يقل عن 10) نقاط البيانات عبر الذروة لتحديد الكميات؛ 3) القيام المعايرة كتلة منخفضة قبل تشغيل عينات؛ 4) عن طريق الحقن لا يزيد عن 5 مل لتجنب الوقت الاحتفاظ تحويل وتوسيع الذروة التي تسببها المياه؛ و5) إعداد وتشغيل عينات للمقارنة في نفس دفعة لتقليل الآثار دفعة واحدة.

معايير (الجدول 1) اختار هنا لانخفاض كتلة معايرة مجموعة قابلة للتبادل. أي مركب معروفة مع م / ض التي تقع في المسح الشامل المدى، وحسن تصرف في مصدر H-ESI، وقابل للذوبان في الماء، والميثانول، أو أسيتونتريل المرشحين معقولة لمعايير المعايرة. ينصح بشدة لتخزين جميع الحلول المعايرة ور 4 درجة مئوية لتحقيق الاستقرار الكافيين وأيضا لتقليل تبخر الميثانول أو أسيتونتريل في حل المعايرة بحيث أداء المعايرة يمكن أن يكون أكثر استنساخه. مقارنة مع مجموعة كتلة العادية، م / ض من 150 إلى 2،000، يحتاج منخفض مجموعة كتلة المعايرة الذي يتعين القيام به على نحو أكثر تواترا، على الأقل مرة كل يومين.

سير العمل هذا، من المذيبات استخراج وإعادة المذيبات، الطور المتحرك LC، إلى انخفاض كتلة مجموعة معايرة وفحص MS وقد تم تحسين مجموعة لقياس نواتج الأيض القطبية. وهذا يشمل الأحماض الأمينية، والأحماض الأمينية الاسيتيل، وسيطة مسار تحلل، النيوكليوسيدات، وسيطة دورة TCA، وبعض من الكربون واحدة وسيطة مسار عملية التمثيل الغذائي وهلم جرا. ومع ذلك، إدخال تعديلات على هذا البروتوكول لفئات أخرى من المركبات، مثل أنزيم A (لجنة الزراعة) الأنواع، بالفولات، الدهون الفوسفاتية ممكنة. على سبيل المثال، شهادات توثيق البرامج هي أكثر استقرارا في الظروف الحمضية، وبالتالي فإن إضافة حمض إلى 80٪ الميثانول / الماء تكون مفيدة للعفريتروف التميم حساسية. أيضا، شهادات توثيق البرامج والدهون تميل إلى أن تكون الكثير من الأوزان الجزيئية الكبيرة، وبالتالي يحتاج تفحص نطاق م / ض إلى تعديل 60-900 إلى النطاق المناسب الذي سيغطي تلك الأيض.

على الرغم من أن بعض نتائج البحث قاعدة بيانات مكون تشتته تتداخل مع القائمة المستهدفة، فإنه لا يزال من الأهمية لبناء هذه القائمة المستهدفة على أساس الأولوية البحثية. منذ الأيض في قائمة المستهدفين هم أقل من متوسط ​​كثافة عتبة، سيتم إزالة المعلومات حول هذه الأيض أثناء معالجة. وتشمل قائمة استهدفت المعلومات في الوقت الاحتفاظ، مما يعطينا ثقة أكبر لتحديد الكميات والأيض. ميزة واحدة أخرى مع الإعداد QE-MS هو أن الطيف جنبا إلى جنب الشامل يمكن أن تسمح لمزيد من التعرف على نواتج الأيض.

قضية واحدة المرتبطة بهذا العمل هو أن الإبرة INSE H-ESIrt غير حساسة لمحتوى الملح من العينات، وحساسية سوف يثير الشبهة إلى حد كبير إذا كانت هناك كميات عالية من الأملاح غير متقلبة. وبالتالي، فإن تقليل محتوى الملح من العينات، والتنظيف الروتيني للعمود وإدراج إبرة H-ESI تكون مفيدة لضمان بيانات ذات نوعية جيدة وزيادة عمر العمود.

باختصار، هذا البروتوكول يعمل LC-MS-التيسير الكمي لتحليل بنجاح الأيض القطبية من الخلايا المستزرعة، مع الحد الأدنى من الخطوات إعداد العينات والحصول على البيانات السريعة. ويمكن إجراء تعديلات صغيرة في إعداد العينات من الحصول على بيانات من مصادر بيولوجية أخرى مثل مصل الدم والأنسجة. على سبيل المثال، منذ الميثانول النقي يمكن أن تضاف إلى السائل المصل تضاف إلى جعل تركيز الميثانول النهائي إلى 80٪ لاستخراج نواتج القطبية. لعينات الأنسجة، مطلوب التحريك دقيق وخلط لتحقيق أفضل كفاءة الاستخراج. عادة 10 مل مصل أو1 ملغ الأنسجة كافية لتحليل نواتج الأيض. ويمكن تحليل البيانات الخام على حد سواء في وضع المستهدفة، إذا كان هناك مستقلبات المعروفة في العينات، وبطريقة هادفة من الامم المتحدة وتليها HRMS البحث قاعدة البيانات. الايض نظام إدارة الموارد البشرية على أساس لا يزال في مراحله المبكرة. عن السلف في المستقبل، وأساليب فنية تجريبية يمكن أن يكون الأمثل أخرى، إضافية المعلومات HRMS الأيض وسوف أنماط تجزئة MS / MS تكون خوارزميات مفيدة وذات الصلة، مثل ذروة المواءمة والتكامل الذروة، نظير تجميع وهلم جرا، ويمكن تحسين كفاءة ودقة معالجة البيانات. في نهاية المطاف، ومع ذلك، فإن العديد من الأسئلة التي عناوين مختبرنا في التمثيل الغذائي محدودة بسبب تفسير دقيق للبيانات بعد معالجة. مع هذه التقنيات الايض على نطاق واسع، ونحن غالبا ما يحد من تفسيرنا للبيانات وتقييم الفرضيات ولدت. لذلك، من الضروري أن تصاغ جميع التجارب الايض حول أسئلة محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه ديتليف شومان، جينيفر ساتون (الحرارية فيشر العلمية) وناثانيل سنايدر (جامعة بنسلفانيا) لإجراء مناقشات قيمة حول المعايرة الشامل ومعالجة البيانات. وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة الوطنية في إطار جائزة عدد R00CA168997. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
  2. Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
  3. Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
  4. Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
  5. Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
  6. Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
  7. Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
  8. Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
  9. Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
  10. Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
  11. Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
  12. Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
  13. Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
  14. Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
  15. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
  16. Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
  17. Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
  18. Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
  19. Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
  20. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
  21. Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
  22. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).

Tags

الكيمياء، العدد 87، عالية الدقة قياس الطيف الكتلي، الايض، الإيجابية / السلبية التبديل، وانخفاض المعايرة الشامل، Orbitrap
استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A.,… More

Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter