Två-foton avbildning, som är kopplad till laser nanodissection, är användbara verktyg för att studera degenerativa och regenerativa processer i det centrala nervsystemet med subcellulär upplösning. Detta protokoll visar hur man märka, bild, och dissekera enstaka klättring fibrer i cerebellar cortex in vivo.
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Axonal transektion till följd av mekanisk skada, giftiga förolämpning eller neurodegenerativa sjukdomar följs vanligen av degeneration av den distala delen av axon som är fristående från cellkroppen 10-13. Med några få undantag 2,7,14,15, avhuggna axoner i CNS hos vuxna djur är oftast inte kan aktivera en återväxt program 16.
Lite är känt om realtids dynamik degenerativa händelser på den cellulära och subcellulära nivå. Utvecklingen av nya strategier för att begränsa nervskada och främja neuronal återväxt kräver, som ett första steg, att klargöra den mekanism genom vilken ovanligt skadade nervceller urarta och regenerera. Denna studie är mest direkt adresseras genom att övervaka dynamiken hos en enda neuron in vivo. Medan en-foton fluorescens avbildningstekniker är begränsade av intensiv spridning av synligt ljus, når tvåfotonexcitering djupa kortikala skikt i live möss med subcellulära upplösning 3,4,17. Med utnyttjande av transgena möss där fluorescerande proteiner selektivt uttrycks i subpopulationer av nervceller 18-20, har TPF mikroskopi tillämpats på utforskandet av synaptisk plasticitet och axonal töjning under utvecklingen in vivo 21,22. D en förmåga ovanligt skadade nervceller att återföds efter skada kan undersökas med koppling in vivo övervakning av två-photon avbildning med en modell av skada speciellt riktade till axonet av intresse. Fler fotonabsorption av femtosecond pulser har använts för att störa enstaka dendriter eller enstaka ryggar 5,23. Dessutom tillåter denna skada paradigm skära enstaka axonal grenar utan att störa kontakt dendritliknande 6. I samband med att dissekera de funktioner som tillåter specifika neuronala befolkningen att regenerera sina axoner gång skadade, cerebellär klättring fibrer (CFS) är en användbar modell since de behåller anmärkningsvärda plastiska egenskaper efter skada även i vuxna djur 24,25. Nyligen, långsiktig avbildning av CFS visade att dessa axoner är kapabla av förnybara i dagarna som följer laser axotomy 6.
Detta protokoll beskriver hur man märka olivocerebellar nervceller och deras axonal töjning genom antero spårning. När neuronerna av intresse är fluorescensmärkt, kan de övervakas upprepade gånger vid godtyckliga tidpunkter i veckor eller månader under en kraniell fönster. Proceduren att dissekera enstaka axonal grenar med laser axotomy in vivo kommer då att belysas.
De tekniker som presenteras här ger nya insikter i mekanismen för axonal ombyggnad in vivo och kan bidra till utvecklingen av terapeutiska strategier för att begränsa neuronal degeneration och främja axonal återväxt.
Detta protokoll visar hur man märka nervceller i sämre oliv med en fluorescerande färg. Därefter används metoden för att göra en kraniell fönster på cerebellar cortex beskrivas. Denna teknik ger optisk access till terminaldelen av olivocerebellar nervceller, klättring fibrerna. Tyvärr, är ganska låg resultatet av både märkning och kraniotomi kirurgi även i händerna på skickliga operatörer (vanligtvis 1 av 3 möss är märkt, och 1 av 3 kraniala fönster förblir klar efter 1-2 veckor).
<p class="j…The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |