Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione
Summary
Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati e la loro disponibilità per applicazioni pratiche.
Abstract
La strategia tradizionale per l'introduzione di funzionalità chimiche è l'uso di sintesi in fase solida aggiungendo precursori Phosphoramidite opportunamente modificati alla catena nascente. Tuttavia, le condizioni utilizzate durante la sintesi e la restrizione di sequenze piuttosto brevi ostacolano l'applicabilità di questa metodologia. D'altra parte, nucleosidi trifosfati modificati vengono attivati blocchi che sono stati impiegati per l'introduzione mite di numerosi gruppi funzionali in acidi nucleici, una strategia che apre la strada per l'uso di acidi nucleici modificati in una tavolozza ampia di applicazioni pratiche come codifica funzionale e generazione di ribozimi e DNAzymes. Una delle maggiori difficoltà risiede nella complessità della metodologia che porta all'isolamento e caratterizzazione di questi analoghi nucleosidici.
In questo articolo video, presentiamo un protocollo dettagliato per la sintesi di these analoghi modificati utilizzando reagenti a base di fosforo-(III). Inoltre, la procedura per la loro caratterizzazione biochimica di divulgazione, con particolare attenzione alle reazioni del primer e TdT tailing polimerizzazione. Questo protocollo dettagliato sarà di uso per la lavorazione di dNTP modificati e il loro ulteriore utilizzo in biologia chimica.
Introduction
5'-trifosfato (nucleosidi (d) PTR) rappresentano una classe di biomolecole vitali che sono coinvolti in innumerevoli processi e funzioni che vanno dall'essere la valuta universale di energia regolatori del metabolismo cellulare. Oltre al loro ruolo in queste trasformazioni biologiche fondamentali, loro omologhi modificati hanno avanzato come piattaforma versatile e delicato per l'introduzione di gruppi funzionali in oligonucleotidi, una metodologia che integra piacevolmente la sintesi in fase solida automatizzata che viene solitamente applicato 1,2. Infatti, a condizione che i (d) PTR possono agire come substrati per RNA e DNA polimerasi 3, una ricchezza di gruppi funzionali, tra cui aminoacidi, acidi 4-13 boronici 14,15, nornbornene 16, residui diamondoide-17, come catene laterali per organocatalisi 18, acidi biliari 19, e anche oligonucleotidi 20 può essere introdotto in oligonucleotidi.
_content "> Oltre che rappresenta una comoda vettoriale per la funzionalizzazione di acidi nucleici, dNTPs modificati possono essere impegnati in SELEX e altri metodi combinatori correlate di selezione in vitro per la generazione di modificati acidi nucleici catalitici 21-30 e aptameri per varie applicazioni pratiche 10, 31-36. Le ulteriori catene laterali che vengono introdotti dalla polimerizzazione dei dNTP modificati sono pensati per aumentare lo spazio chimico che può essere esplorato durante un esperimento di selezione e integrare l'arsenale funzionale piuttosto povera di acidi nucleici 37. Tuttavia, nonostante questi tratti interessanti e recenti progressi nello sviluppo sia di sintesi e di analisi, universalmente applicabile e alla procedura ad alto rendimento esiste per la lavorazione di modificati trifosfati nucleosidici 2,38.L'obiettivo del presente protocollo è quello di far luce nel (a volte) le procedure intricate leader to la sintesi e caratterizzazione biochimica di questi blocchi attivati (Figura 1B). Sarà data particolare enfasi su tutti i dettagli sintetici che spesso sono difficili da trovare o sono assenti nelle sezioni sperimentali, ma sono ancora cruciali per il buon esito del percorso di sintesi che porta all'isolamento di puri (d) PTR (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
L'inclusione di modifiche in acidi nucleici è di interesse per numerose applicazioni pratiche, tra cui lo sviluppo di agenti antisenso e antigene 42,43, l'etichettatura e tagging funzionale di oligonucleotidi 41, e negli sforzi per espandere l'alfabeto genetico 44-46. Le alterazioni chimiche e gruppi funzionali sono generalmente introdotti in acidi nucleici mediante l'applicazione di protocolli di sintesi in fase solida standard e automatizzati. Tuttavia, i mattoni Phosp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann Si ringrazia per la fornitura di spazi e attrezzature di laboratorio, nonché per il suo costante sostegno. La signora Sue Knecht è riconosciuto per le discussioni fruttuose.
Materials
| tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| Biochemical reagents | |||
| g-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo–) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Equipment | |||
| Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| Oligonucleotides | |||
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: | |||
| Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330 | |||
| Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F. |
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