Summary

Nukleosidtrifosfaterna - Genom syntes till Biochemical karakterisering

Published: April 03, 2014
doi:

Summary

Protokollet som beskrivs här syftar till att förklara och förkorta de många hinder i vägen för den intrikata vägen som leder till modifierade nukleosidtrifosfater. Följaktligen underlättar detta protokoll både syntesen av dessa aktiverade byggstenar och deras tillgänglighet för praktiska tillämpningar.

Abstract

Den traditionella strategin för införandet av kemiska funktionaliteter är användningen av fast-fas-syntes genom att lägga lämpligt modifierade fosforamidit prekursorer till den framväxande kedjan. Men de villkor som används under syntesen och begränsningen till ganska korta sekvenser hindra tillämpligheten av denna metod. Å andra sidan, är modifierade nukleosidtrifosfater aktiverade byggstenar som har använts för den milda inledningen av ett stort antal funktionella grupper i nukleinsyror, en strategi som banar väg för användning av modifierade nukleinsyror i en bred palett av praktiska tillämpningar såsom funktionell märkning och generering av ribozymer och DNAzymes. En av de stora utmaningarna är bosatt i intrikat av den metod som leder till isolering och karakterisering av dessa nukleosidanaloger.

I denna video artikeln presenterar vi ett detaljerat protokoll för syntes av these modifierade analoger med hjälp av fosfor (III)-baserade reagenser. Dessutom är det förfarande för biokemisk karakterisering röjas, med särskild tonvikt på primerextensionsprodukter reaktioner och TdT svans polymerisation. Denna detaljerade protokoll kommer att vara till nytta för att tillverka av modifierade dNTP och deras vidare användning i kemisk biologi.

Introduction

5'-nukleosidtrifosfater ((d) NTP) representerar en klass av viktiga biomolekyler som är inblandade i otaliga processer och funktioner som sträcker sig från att vara den universella valutan av energi till regulatorer av cellmetabolism. Förutom deras roll i dessa fundamentala biologiska förändringar, har sina modifierade motsvarigheter fram som en mångsidig och mild plattform för införandet av funktionella grupper i oligonukleotider, en metod som fint kompletterar den automatiska fastfassyntesen som brukar tillämpas 1,2. I själva verket, förutsatt att (d) NTP kan fungera som substrat för RNA-och DNA-polymeraser 3, en mängd funktionella grupper bland aminosyrorna 4-13, boronsyror 14,15, nornbornene 16, diamondoid liknande rester 17, sidokedjor för organocatalysis 18, gallsyror 19 och till och med oligonukleotider 20 kan föras in i oligonukleotider.

_content "> Bortom representerar ett bekvämt vektor för funktionalisering av nukleinsyror, kan modifierade dNTP vara engagerade i SELEX och andra kombinatoriska metoder för in vitro-selektion för generering av modifierade katalytiska nukleinsyror 21-30 och aptamers för olika praktiska tillämpningar 10, 31-36. De extra sidokedjor som införs genom polymerisation av de modifierade dNTP tros öka den kemiska utrymme som kan utforskas under ett urval experiment och komplettera ganska dålig funktionella arsenal av nukleinsyror 37. Trots dessa attraktiva egenskaper och den senaste tidens framsteg som gjorts i utvecklingen av både syntetiska och analytiska metoder, inte allmängiltiga och högavkastande förfarande existerar för crafting av modifierade nukleosidtrifosfater 2,38.

Syftet med detta protokoll är att belysa i den (ibland) invecklade procedurer leder to syntesen och biokemisk karaktärisering av dessa aktiverade byggstenarna (Figur 1B). Särskild vikt kommer att läggas på alla syntetiska detaljer som ofta är svåra att hitta eller är frånvarande i experimentella sektioner men är ändå avgörande för ett framgångsrikt slutförande av den syntetiska väg som leder till isolering av rena (d) NTP (Figur 1).

Protocol

1. Syntes av de modifierade nukleosidtrifosfatema Den syntetiska strategi som valts följer det förfarande som utvecklats av Ludwig och Eckstein eftersom denna metod är i allmänhet pålitliga och leder till mycket få sidoprodukter (Figur 1A) 39. Samindunsta den lämpligen 3'-OAc-skyddad nukleosid (typiskt 0,1 mmol) två gånger med vattenfri pyridin (2 ml) och torka sedan under vakuum över natten. Samtidigt, torr tributylammoniumpyrofosfat (0,1…

Representative Results

Modifierade nukleosidtrifosfater är lockande syntetiska mål eftersom de möjliggör den enkla införandet av ett brett spektrum av funktionella grupper i nukleinsyror 41. Emellertid är isolering och karakterisering av dessa aktiverade byggstenarna ofta visar sig vara mödosam. Följaktligen är de resultat som visas häri tänkt att ge en hjälpande hand för att följa de olika stegen inom tidigare nämnda syntetiska och biokemiska förfaranden (se figur 1b). …

Discussion

Införandet av ändringar i nukleinsyror är av intresse för många praktiska tillämpningar, inklusive utvecklingen av antisens-och antigenmedel 42,43, märkning och funktionell märkning av oligonukleotider 41, och i arbetet med att utvidga den genetiska alfabetet 44-46. Kemiska förändringar och funktionella grupper vanligen införes i nukleinsyror genom användning av standard-och automatiserade fastfas-syntesprotokoll. Men fosforamiditmetoden byggstenar måste vara motståndskraft…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 och PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann är tacksamma för att tillhandahålla labb utrymme och utrustning, liksom för hans ständiga stöd. Ms Sue Knecht är känd för givande diskussioner.

Materials

tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

References

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates – Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2′-Modified Ribonucleoside 5′-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2′-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. r. g. . 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -. L., Marx, A. . Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2′-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5′-0-(1-thiotriphosphates), 5′-triphosphates and 2′,3′-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H., Murphy, J. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. 9, 237-275 .
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies – Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3′-end protection using 2′,4′-bridged nucleoside-5′-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).
check_url/51385?article_type=t&slug=nucleoside-triphosphates-from-synthesis-to-biochemical

Play Video

Cite This Article
Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates – From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

View Video